乳腺癌肿瘤内异质性的驱动因素及临床研究进展*

赵洪猛 曹旭晨

乳腺癌是根据肿瘤生物学的分子特征指导治疗决策的典范。通过免疫组织化学法检测雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的表达差异，可将乳腺癌进行简便粗略的分类。PAM50（prediction analysis of microarray 50）分类系统首次进行了乳腺癌较为精确完整的分子分型，该系统将乳腺癌分为管腔A型（Luminal A）、管腔B型（Luminal B）、HER-2过表达型（HER-2-enriched）和基底样型（Basal-like）不同的固有亚型[1]。但单纯将乳腺癌进行绝对的分型并不能完全解释乳腺癌预后的差异。与分子分型理论不同，肿瘤内异质性（intratumoral heterogeneity，ITH）是指在单个肿瘤中存在多个不同亚型，且不同亚型存在动态转化。本文将对乳腺癌ITH的驱动因素和临床意义的研究进展进行综述。

1 ITH的驱动因素

1.1 细胞状态异质性

正常乳腺分化具有复杂的层级结构，最顶端为乳腺干细胞，可在生理刺激下再生或分化。通过正常乳腺细胞分化层级架构建立细胞状态模型，有助于解释单个肿瘤内可能存在的多种细胞状态。Yeo等[2]研究发现，在肿瘤细胞状态谱中，乳腺癌亚型具有可塑性，不同亚型间可相互转化。该研究对3种不同的乳腺癌小鼠模型（MMTV-PyMT、MMTV-Neu和BRCA1-Null）进行了单细胞转录组测序，在每种肿瘤中均发现了乳腺癌多种亚型存在的证据，提示一个复杂的肿瘤组织可能具有多种细胞状态，可在乳腺肿瘤内诱导异质性。另外，肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）在肿瘤进展及治疗耐药中发挥重要作用。目前认为，CSC是存在于肿瘤组织中小部分具有干细胞性质的细胞亚群，通过不对称分裂，产生保留有相同性质的CSC以及不同分化程度、占肿瘤大部分的非致瘤性肿瘤细胞[3]。Saha等[4]研究发现多种不同的CSC分子标记物，如CD44+/CD24-/low、ALDH+、CD133+和PROCR+等。CSC标记物异质性可能是一种微环境特异性行为，也可能是由于不同的空间和时间因素导致。因此，多种细胞状态可能赋予CSC不同表型，进而导致ITH[5]。

1.2 肿瘤微环境

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）由肿瘤细胞、基质细胞和细胞外基质等组成，与肿瘤发生发展密切相关。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）是TME的主要组成部分，通过产生促肿瘤细胞外基质结构、生成生长因子、调节肿瘤免疫、调节化疗耐药和促进转移来促进肿瘤进展[6]。CAF可直接或间接影响乳腺癌表型的表达。近期研究表明，CD63+CAF通过分泌富含miR-22的外泌体，下调乳腺癌细胞中ER的表达，导致TAM耐药[7]。Roswall等[8]研究发现，基底样亚型乳腺癌的血小板衍生生长因子-CC（platelet derived growth factor-CC，PDGF-CC）呈现高表达，与CAF存在旁分泌交互通路，PDGF-CC的表达可能决定了肿瘤的分子亚型。另外，CAF本身的异质性也会导致肿瘤治疗耐药的不同。在乳腺癌不同分子亚型中，4种类型的CAF表达存在差异，如CAF-S1和CAF-S4在三阴性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）中的表达更多[9]。CAFS1亚型可通过上调CD25HighFOXP3HighT细胞和增强调节性T细胞（Treg）能力来诱导免疫抑制环境，进而影响免疫治疗疗效。CAF异质性及其对肿瘤治疗耐药的作用是未来研究的一个重要领域。

1.3 克隆进化

遗传因素在ITH的发展中也起着不可或缺的作用。研究发现，1例转移性ER+/HER-2+乳腺癌患者行超过3年的靶向治疗后，出现了由克隆进化引起的时间异质性[10]。该研究发现ctDNA可预测克隆进化，不同部位转移病灶的亚克隆突变与治疗反应直接相关。对克隆进化研究较充分的一个重要通路是Wnt信号通路。Cleary等[11]首次证明，Wnt信号诱导的混合谱系肿瘤符合单个祖细胞产生的层级结构，与产生基底样型或管腔型亚克隆的多克隆细胞相符。Wnt信号通路在驱动乳腺癌细胞不同表型中的作用，为防止克隆进化和ITH形成提供了一个潜在的靶点。

1.4 代谢重编程

代谢重编程（metabolic reprogramming）是恶性肿瘤的标志之一。肿瘤细胞的代谢重编程是为了适应肿瘤对于物质、能量的需求，其中有多种代谢通路参与，包括葡萄糖代谢、谷氨酰胺代谢及脂质代谢等。与前述驱动因素导致肿瘤基因表型的差异不同，代谢重编程主要引起代谢原料及产物的变化，大多是由于大分子翻译后修饰的结果[12]。不同的肿瘤之间以及肿瘤内同样存在着代谢异质性（空间异质性）并导致不同肿瘤的疗效差异；而肿瘤从癌前病变发展成浸润性癌，进而转移的过程中，代谢表型及代谢依赖性也都在发生改变（时间异质性）[13]。因此，肿瘤中广泛存在的代谢异质性，也成为驱动ITH的重要因素之一。

2 ITH的临床意义

2.1 空间异质性对肿瘤原发病灶的影响

在临床上，同一肿瘤的不同区域可通过免疫组织化学法显示出ER、PR和HER-2不同水平的表达。通过对8个乳腺癌原发病灶及4种细胞系行单细胞测序检测发现，肿瘤内存在大量不同突变谱的亚克隆[14]。质谱流式成像技术（imaging mass cytometry，IMC）也被用于空间异质性的研究。通过对352例乳腺癌患者行IMC检测及单细胞分析发现，乳腺癌的表型异质性在空间上局限于不同的区域，具有高度空间异质性表型的患者预后较差[15]。针对ITH的治疗策略必须足够广泛而强大，以对抗源自这种异质性的阻力。推荐的解决方案包括联合治疗、利用乘客突变、根除“致命”克隆、适应性治疗、靶向TME和免疫治疗等[16]。

2.2 时间异质性的对转移病灶的影响

乳腺癌亚型的分子特征并非恒定不变，不同亚型间可相互转化。通过对原发病灶与转移病灶的比较，可最好地理解导致ITH的时间演变。Priedigkeit等[17]对20例乳腺癌原发病灶和脑转移病灶进行了分析，结果发现在13例HER-2-患者中，3例脑转移病灶为HER-2+，不仅表明亚型之间可动态转化，也提示对转移病灶行靶向治疗的潜力。虽然HER-2-原发病灶到HER-2+脑转移病灶之间的转化机制尚不清楚，但可能是因大脑中的微环境有利于HER-2信号转导。亚型之间的动态转化并不限于脑转移。一项针对390例乳腺癌患者的临床研究，比较了原发病灶和转移病灶的分子表达，发现ER、PR和HER-2的表达在原发病灶和转移病灶间频繁地转化[18]。该研究的原发病灶与转移病灶中的ER、PR和HER-2分别在18.3%、40.3%和13.7%患者中出现不一致，而这些转化取决于转移病灶的微环境，在骨和中枢神经系统的ER转化率较高，而肝脏的ER转化率较低。Garcia-Recio等[19]研究发现，在Luminal A型肿瘤的一组患者中，虽存在HER-2+转移病灶，但对靶向HER-2治疗仍无效。在该研究中，内分泌治疗引起获得性耐药并诱导HER-2+表型表达，但在抑制成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）后，HER-2+表型恢复为更惰性的Luminal A型。乳腺癌亚型之间的动态转化是肿瘤治疗耐药和转移的潜在分子机制，在复发转移性乳腺癌的临床决策中需充分考虑这些因素的影响。

2.3 ITH对治疗耐药的影响

肿瘤间和ITH均被认为可介导治疗耐药。Guarneri等[20]检测107例HER-2+乳腺癌患者的病理反应率，与行化疗联合靶向治疗的患者相比，行单纯的新辅助化疗的患者出现HER-2表达缺失的比例更高，HER-2表达缺失与复发率增加有关，提示肿瘤动态转化成为化疗耐药的表型。在一项日本的新辅助化疗研究中，大多数乳腺癌患者仅行单纯的化疗方案，有21.4%患者的肿瘤初始HER-2+在新辅助治疗后转化为HER-2-[21]。该研究进一步表明了表型的动态转化与耐药的关系。此外，代谢重编程也参与到HER-2+乳腺癌的耐药过程。利用脂肪酸合酶（FASN）抑制剂，可使曲妥珠单抗或拉帕替尼耐药的乳腺癌细胞恢复敏感性[22]。而另有研究证实，二甲双胍可通过多种途径影响肿瘤细胞的代谢，进而对抗HER-2+乳腺癌的靶向耐药[23]。TNBC患者的肿瘤本质上存在明显异质性，在化疗敏感的TNBC肿瘤中存在化疗耐药亚群。TNBC固有的异质性提供了更多样化的细胞群，可以从中获得化疗耐药。

肿瘤的进化也是导致乳腺癌治疗耐药的原因之一。Brady等[24]利用全外显子组、单细胞RNA测序发现，4例转移性ER+乳腺癌患者有克隆进化。已存在的耐药表型，包括增强的间质/生长信号（促进耐药）和降低的抗原呈递/肿瘤坏死因子-α信号转导（免疫抑制），成为治疗后的主要表型。Kim等[25]利用单细胞DNA和RNA测序发现，TNBC耐药患者适应性基因组的选择和转录重编程具有克隆持久性。在HER-2过表达的亚型中，使用2种不同的抗HER-2药物（拉帕替尼和曲妥珠单抗）治疗的患者诱导出低增殖性的Luminal A表型[26]。为克服ITH导致的耐药，需要不同分子机制中关键靶点的发现和新型靶向药物的研发，也会将乳腺癌的分子靶向治疗推向一个更高的层面。

3 结语

ITH促进了疾病进展和治疗耐药，确定其分子驱动因素（尤其是TME）并了解对转移和耐药的影响，将对未来的治疗方法进行指导。以单细胞分辨率分析肿瘤（如转录组分析）揭示了仅进行肿瘤的整体分析而被忽视的异质性，有助于确定驱动耐药的关键靶点。单细胞空间转录组测序技术以及对保留细胞结构关系的单细胞分析（如类器官模型）等新技术的出现，将进一步扩展对乳腺肿瘤异质性的理解，有助于开发个体化的靶向治疗新策略。