胆管刷检细胞学及K-Ras基因突变检测在恶性胆管梗阻早期定性诊断中的价值

许颖颖，王倩倩，秦耿，房龙*

（1.中日友好医院 消化内科，北京 100029；2.北京大学医学部 中日友好临床医学院，北京 100029）

胆管梗阻是消化内科常见的疾病，恶性梗阻根治性手术切除率低，预后差，因此，尽早对胆管梗阻良恶性鉴别诊断至关重要，尤其对于有根治机会的早期恶性梗阻患者，而对于良性梗阻患者，也可以避免不必要的手术或药物干预[1]。然而，血液生化检查、无创性腹部影像学检查往往无法做出准确诊断，易导致漏诊或误诊，延误最佳治疗时机，最终的确诊仍有赖于病理学证据。目前，内镜下逆行性胰胆管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）胆管刷检仍是获取病理学证据的主要手段，贴近病变刷检获取病理的同时，又可以避免胆管活检造成胆道出血、穿孔等风险[2]。而当细胞学诊断依据不充分时，随着分子生物学技术的发展，胆管刷检细胞学与KRas 基因突变联合检测是否可提高对恶性胆管梗阻的诊断效果，尚需要临床进一步验证。本研究对胆管梗阻患者进行胆管刷检、K-Ras 基因突变检测，对两种诊断方法单独及联合检测诊断恶性胆管梗阻的灵敏度、特异度、准确率进行评价和比较，评估胆管刷检细胞学、K-Ras 基因突变检测在恶性胆管梗阻早期定性诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

以2021 年1 月—12 月因胆管梗阻在中日友好医院消化科住院治疗的患者为研究对象。入选标准：（1）年龄及性别不限；（2）腹部B 超、CT 或核磁证实肝内外胆管梗阻；（3）进行ERCP 手术的患者。排除标准：（1）全身一般情况差，不能耐受胃镜检查及ERCP 胆管刷检；（2）凝血功能障碍，无法耐受有创性操作；（3）除肝胆胰外的其他脏器恶性肿瘤伴肝脏转移导致肝内外胆管受累；（4）任何原因导致的食管胃底静脉重度曲张者。

良恶性胆管梗阻诊断标准：病理学未见明确恶性肿瘤证据，包括胆管活检病理、追加手术后病理、胆管刷检、胆汁细胞学等，或临床随访半年以上仍未发现恶性征象且患者生存良好者，最终诊断为良性胆管梗阻；病理学证实存在恶性肿瘤，或临床随访证实为恶性病程者，最终诊断为恶性胆管梗阻。

1.2 研究方法

1.2.1 胆管刷检：患者俯卧或侧卧于手术床，全身静脉麻醉后，常规ERCP 操作，首先采用电子十二指肠镜（日本Olympus TgF）进镜至十二指肠降段乳头开头处，插入黄斑马导丝，体外X线透视确认导丝进入到胆管内，随后碘伏醇造影明确胆管梗阻部位，沿导丝插入细胞刷（美国Boston Scientific RX Cytology Brush），在胆管梗阻部位刷检2次，每次在胆管梗阻部位往复移动大约10 次，刷检细胞全部置入液基细胞瓶（中国厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司Non-GYN 型），半小时内送至病理科，1 份进行细胞学检测，1 份进行KRas基因突变检测。

细胞学阳性判断标准[3]为：（1）细胞大小不等，排列紊乱；（2）细胞核增大，核外形不规则，染色质增粗，核深染；（3）核浆比例（核质比）增大。中日友好医院病理科将细胞学诊断划分为：癌细胞、高度可疑癌细胞、可疑癌细胞、核异质细胞、未见癌细胞。癌细胞、高度可疑癌细胞、可疑癌细胞或核异质细胞提示病理学存在恶性肿瘤证据。

1.2.2 K-Ras 基因突变检测：留取1 份胆管刷检细胞液，进行K-Ras 基因第2、3、4 外显子突变检测，结果分为突变型及野生型，存在K-Ras基因突变者提示恶性胆管梗阻。

1.2.3 胆管刷检联合K-Ras 基因突变检测：采用胆管刷检联合K-Ras 基因突变进行诊断时，其中任何一种方法阳性，即可诊断为恶性胆管梗阻。

1.3 统计学方法

应用SPSS24.0 进行统计学分析。以病理学及临床随访结局作为金标准，比较胆管刷检、KRas 基因突变及胆管刷检联合K-Ras 基因突变对恶性胆管梗阻定性诊断的灵敏度、特异度、准确率等指标。率的比较采用χ2检验进行统计分析。

2 结果

2.1 患者纳入及最终诊断

2021 年1 月—12 月，本研究共纳入93 例胆管梗阻患者，其中2 例患者退出，要求转外院治疗或返家，1例胃癌伴肝脏转移，1例食管胃底静脉重度曲张。结合病理学及半年的临床随访，确诊良性胆管梗阻32 例，恶性胆管梗阻57 例，其中有原发性胆管恶性肿瘤46例，胰腺恶性肿瘤11例（图1）。

图1 患者纳排流程图

2.2 胆管刷检及K-Ras基因突变的诊断价值

2.2.1 胆管刷检诊断结果

表1 示细胞学阳性率，恶性胆管梗阻患者为52.6%（30/57），良性胆管梗阻患者为3.1%（1/32）。胆管刷检细胞学诊断恶性胆管梗阻的灵敏度为52.6%（30/57），特异度为96.9%（31/32）。

表1 胆管刷检对胆管梗阻的定性诊断

2.2.2 K-Ras基因突变诊断结果

表2 示K-Ras 基因突变率，恶性胆管梗阻患者为60.8%（31/51），良性胆管梗阻患者0（0/32）。K-Ras 基因突变对恶性胆管梗阻定性诊断的灵敏度为60.8%（31/51），特异度为100%（32/32）。

表2 K-Ras基因突变对胆管梗阻的定性诊断

2.2.3 胆管刷检与K-Ras基因突变诊断结果的交叉对比

表3 示，在57 例恶性胆管梗阻中，30 例胆管刷检细胞学呈阳性，其中15 例可见明确癌细胞，4例高度可疑/可疑癌细胞，11 例可见核异质细胞，K-Ras 基因突变率相应为86.7%（13/15）、75.0%（3/4）、72.7%（8/11）。在15 例可见明确癌细胞的患者中，K-Ras 基因突变率也未能达到100%，仍有2例患者K-Ras 基因为野生型。27例细胞学阴性患者中，7 例发生K-Ras 基因突变，表明在恶性胆管梗阻中，胆管刷检细胞学阴性而K-Ras 基因发生突变者达25.9%（7/27）。因此，需将胆管刷检细胞与K-Ras基因突变进行联合检测。

表3 胆管刷检与K-Ras基因突变诊断结果的交叉对比

2.2.4 联合检测诊断结果

表4 示，胆管刷检联合K-Ras 基因突变诊断恶性胆管梗阻的灵敏度为72.5%（37/51），特异度为96.9%（31/32）。

表4 胆管刷检联合K-Ras基因突变检测对胆管梗阻的定性诊断

2.2.5 3种检测方法的诊断结果比较

表5 示，胆管刷检联合K-Ras 基因突变检测可提高对恶性胆管梗阻诊断的灵敏度，增加诊断的准确率，与胆管刷检细胞学检测比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），同时降低误诊率。

表5 3种定性诊断方法的比较

3 讨论

为评估胆管刷检、K-Ras 基因突变及两者联合检测这3 种检测方法对恶性胆管梗阻定性诊断的价值，本研究最终纳入89 例胆管梗阻患者，其中57例恶性胆管梗阻，32例良性胆管梗阻。胆管刷检诊断恶性胆管梗阻的灵敏度、特异度、准确率分别为52.6%、96.9%、68.5%，K-Ras 基因突变的诊断结果为60.8%、100%、75.9%，胆管刷检与KRas 基因突变联合检测的灵敏度可提高至72.5%（37/51），准确率可提高至81.9%（68/83），与胆管刷检细胞学检测比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），可推荐作为恶性胆管梗阻定性诊断的常规检测手段。

3.1 恶性胆管梗阻早期定性诊断的临床意义

胆管癌是继肝细胞癌之后第二大常见的肝脏恶性肿瘤[4]。在解剖学上，胆管癌可划分为肝内、肝门区和肝外胆管癌，其中以肝内胆管癌最为常见。肝炎病毒感染、炎症、吸烟饮酒、肥胖、糖尿病等均认为是胆管癌的危险因素[5]。最新的全球癌症流行病学调查数据显示，在过去的几十年中，胆管癌的发病率和死亡率在全球范围内呈逐步上升趋势[6]。手术切除是唯一的根治方法，然而，胆管癌恶性程度高，很少能在早期确诊，大多数患者确诊时已发展至不能手术切除的晚期阶段，即使存在手术机会，在完全手术切除后，也存在术后短期内复发及远处转移的风险，预后极差，据文献报道，确诊后患者生存期＜12 个月，5 年生存率仅为5%～15%[4，7]。因此，对于可能治愈的早期胆管癌，早期准确诊断至关重要。

3.2 胆管刷检细胞学对恶性胆管梗阻的定性诊断价值及影响因素

早期鉴别良性和恶性胆管梗阻是非常困难的，尽管在过去的数十年里已经发展了多探测器计算机断层扫描、核磁共振胰胆管造影及超声内镜等检查，但单纯影像学检查对恶性胆管梗阻的诊断效果仍然有限。随着内镜技术的发展，ERCP被广泛用于获取不明性质胆管梗阻的病理学证据，包括胆管活检、胆管刷检等，理论上，胆管活检可以获取更大的组织样本并做出更准确的病理学诊断，但由于技术难度大，胆道出血、穿孔手术风险高，手术操作时间长，在很大程度上限制了胆管活检在临床中的广泛应用[8]。因此，ERCP 胆管刷检仍然是目前胆管癌的主要诊断方法，因为它在技术上易于实施，手术时间短，并发症发生率低，但其灵敏度和特异度比较有限，还存在很大的改进空间[2，9]。比如最近一项研究表明，在55例已明确诊断为恶性胆管梗阻患者中，单纯胆管刷检细胞学的灵敏度仅为47.1%[9]。与之相似，日本学者进行的一项研究表明，胆管刷检对恶性胆管梗阻定性诊断的灵敏度、特异度、准确率分别为36.1%、100%、50.0%。而在本研究中，胆管刷检的灵敏度为52.6%，灵敏度为中等水平，与既往研究结果不完全一致，但符合文献研究中的灵敏度波动范围。

细胞学诊断的灵敏度会受到诸多因素影响，可能的因素包括：刷检细胞量[1]、重复刷检频率、内镜医师的技术、细胞学病理医师的经验、总胆红素水平、患者年龄、肿块＞1cm[10]、梗阻长度＞1cm[11]，上述因素均可能影响胆管刷检细胞学的阳性率。细胞量获取不足被认为是细胞学灵敏度低下的主要原因，提示在临床实践中，应在胆管梗阻部位重复多次刷检，以尽可能提高胆管刷检细胞学的阳性率[1]。既往一项研究的单因素联合多因素逻辑回归分析发现，年龄增长、总胆红素水平升高及肿块大小是细胞学阳性的独立预测因素[10]。而另一项研究的多元逻辑回归分析表明，总胆红素水平＞4mg/dl 是胆管刷检细胞学阳性的独立预测因素，这表明总胆红素水平可能影响胆管刷检细胞学的诊断效果[8，10]。据文献报道，受上述多因素的影响，胆管刷检细胞学灵敏度波动于20%～50%，单纯细胞学检测无法满足临床实际需求，需联合其他诊断方法进一步提高诊断的灵敏度。

3.3 K-Ras 基因突变对恶性胆管梗阻的定性诊断价值

随着分子生物学技术的快速发展，对胆管癌生物学行为、潜在发生发展机制、靶向治疗药物及预后标志物的探索均已进入分子时代。例如Morita 等[4]指出经过数十年对胆管癌基因组的探索，基于基因组学特征，已成功开发出针对胆管癌的临床分子靶向药物，如成纤维细胞生长因子受体抑制剂（fibroblast growth factor receptor，FGFR）和异柠檬酸脱氢酶抑制剂（isocitrate dehydrogenase，IDH）。再如Kinjo 等[7]通过对胆管癌患者进行预后生存分析，发现SUOX 和GLUT1 可作为胆管癌的新型预后生物标志物。然而，总体预后差，药物治疗效果欠满意，促使研究者们重新聚焦于胆管癌的早期诊断。有研究发现，与胆管癌相关的几种潜在驱动突变包括K-Ras、p53、IDH1 和PTEN 等[10]，其中又以K-Ras 和p53 研究较为广泛[12]。K-Ras 为RAS 基因家族的一名重要成员，含有4个编码外显子和1个非编码外显子，共同编码KRAS 蛋白，又称为p21 蛋白，在调节肿瘤微环境，以及细胞增殖、侵袭迁移等细胞生物学过程中发挥重要作用[13]。研究表明，K-Ras 基因的功能增益突变为胆管癌中最常见的变化之一，活化的K-Ras 基因突变导致Ras/Raf/MEK/ERK 通路发生级联反应和过度活化，肿瘤细胞过度增殖而凋亡减少，从而导致胆管癌的发生发展[14，15]。鉴于KRas 基因突变在胆管癌发生发展中的核心地位，国内曾有研究评估了K-Ras基因突变对胆管癌定性的诊断价值，结果显示在胆管癌患者中，K-Ras基因突变率为30.0%～43.75%，定性诊断胆管癌的灵敏度、特异度、准确率分别为38.46%、100%、61.9%[1]。而另一项研究的研究结论与之相反，胆管癌患者的K-Ras 基因突变率高达77.19%[16]，这与我们的研究结果较为接近。

综上，在恶性胆管梗阻的定性诊断中，单一的诊断方法各有优劣、很难得出最终诊断结论，将多种诊断方法结合起来可能更有助于做出准确的诊断。因此，胆管刷检细胞学与K-Ras 基因突变联合检测的诊断效果优于单一方法检测，联合检测有助于恶性胆管梗阻的早期定性诊断，建议广泛应用。当然，本研究的局限之处在于单中心、小样本，还需在前瞻性、多中心的大规模研究中进一步验证。