PD-1基因单核苷酸多态性与肝细胞癌临床表型的相关性研究

陆小华 袁洪新▲ 苏靓靓

1.南通大学附属医院介入放射科，江苏南通 226001；2.南通大学附属医院医学影像科，江苏南通 226001

肝细胞癌是临床常见恶性肿瘤，其病死率高居我国恶性肿瘤第二位。肝细胞癌的形成和进展是由不同因素相互作用、多基因协同参与、多靶点多通路共同调控的复杂过程[1]。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是在基因组水平由单个核苷酸变异所引起的DNA 序列多态性。自发现至今，其已不仅作为预判疾病罹患风险的重要依据，还有望成为预估疗效及预后的生物标志物[2]。目前其与肝细胞癌形成及转归存在关联的报道较多[3-5]。对于肿瘤微环境的研究目前已成为热点。免疫抑制机制在肿瘤形成发展的过程中占据主导地位，免疫T 细胞的耗竭是其中最重要的因素。研究表明，肿瘤T 细胞耗竭的重要标志包括程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）在内的多种负性共刺激分子高表达，在T 细胞免疫反应的负调节过程中发挥重要作用[6]。通过开展体内外基础及临床研究，开发相关药物，阻断这些分子的信号传导通路，降低它们的表达水平，恢复T 细胞作为免疫屏障抵抗肿瘤的功能。其中，PD-1 是目前研究的热门靶点，针对其设计的多种免疫药物已应用于临床[7-9]。

已有多种恶性肿瘤易感性与PD-1 基因SNP存在关联的报道[10-11]，但其与肝细胞癌临床表型相关的报道不多。本研究选取PD-1 基因中最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）>5%，文献中较多涉及且可经外周血标本进行基因分型的rs10204525 位点、rs2227982 位点、rs36084323 位点作为研究对象[12-13]，探究该基因SNP 与肝细胞癌临床表型之间是否存在关联性，以期为肝细胞癌个体化治疗及预后判断提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年1—12月南通大学附属医院介入放射科收治的新发肝细胞癌患者165 例，入组后进行临床相关资料收集及外周静脉血标本采集。纳入标准：①首诊初治的肝细胞癌患者；②体力状况评分（PS）<3 分患者。排除标准：①非首诊初治肝细胞癌患者；②体力状况评分（PS）≥3 分患者。其中男120 例（72.73%），女45 例（27.27%）；年龄25～90 岁，平均（62.20±1.24）岁；BCLC A 期17 例（10.3%），B 期90 例（54.55%），C 期58 例（35.15%）；有门静脉侵犯31 例（18.79%），无门静脉侵犯134 例（81.21%）；有肝外转移39 例（23.64%），无肝外转移126 例（76.36%）。诊断标准参考《原发性肝癌诊疗指南（2022年版）》[14]，156 例满足临床诊断标准，另有9 例经穿刺活检满足病理诊断标准。依据BCLC 分期标准加以分期。医院医学伦理委员会对本研究资料收集和血标本采集批准认可。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 混匀型干式恒温器（TND03-H-H，Thermo Fisher 公司）；台式离心机（Pico-21，Thermo Fisher 公司）；DNA 快速抽提试剂盒（上海生工公司）；漩涡混合器（GL-88B，其林贝尔仪器制造有限公司）；电泳槽（DYCZ-21，北京市六一仪器厂）；Synergy LX MULTI-Mode Microplate Reader（BioTek 公司）；HiSeq XTen 测序仪（Illumina 公司）。

1.2.2 位点分型 ①DNA 抽提：使用DNA 快速抽提试剂盒提取基因组DNA，冻存备用；②位点分型：利用包括cutadapt 软件、prinseq-lite 软件、bwa软件、annovar 软件等在内的panel 高通量数据分析技术进行相关位点基因分型。

1.3 统计学方法

本研究数据采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析。计数资料用[n（%）] 表示，采用χ2检验比较各位点突变基因型与野生基因型在不同临床表型中的频数分布差异，各位点突变基因型与野生基因型在肝细胞癌不同临床表型之间的关联强度采用比值比（odds ratio，OR）及其95% 置信区间（confidence interval，CI）的形式表示，并对P值、OR值从性别、年龄等方面进行校正。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs36084323 SNP与肝细胞癌临床表型的相关性分析

以该位点野生基因型CC 患者作为对照，杂合突变基因型CT 的患者分期偏晚的风险降低（OR=0.306，95%CI：0.118～0.679，P< 0.05）；出现门静脉侵犯的风险降低（OR=0.239，95%CI：0.098～0.631，P< 0.05）；发生肝外转移的风险降低（OR=0.394，95%CI：0.165～0.833，P< 0.05）。纯合突变基因型TT 患者与野生型CC 患者相比，在肝细胞癌BCLC 分期、门静脉侵犯、肝外转移等临床表型之间比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。见表1。

表1 rs36084323 SNP与肝细胞癌临床表型的相关性分析

2.2 rs10204525 SNP与肝细胞癌临床表型的相关性分析

以该位点野生基因型CC 患者作为对照，携带杂合突变基因型CT、纯合突变基因型TT 患者分别与野生基因型相比，在BCLC 分期、门静脉侵犯、肝外转移方面比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。见表2。

2.3 rs2227982 SNP与肝细胞癌临床表型的相关性分析

以该位点野生基因型GG 患者作为对照，携带杂合突变基因型AG、纯合突变基因型AA 患者分别与野生基因型相比，在BCLC 分期、门静脉侵犯、肝外转移方面比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。见表3。

3 讨论

PD-1 属于CD28 家族成员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，基因定位2q37.35，其在T 细胞、B 细胞、NK细胞、DC 细胞等多种细胞中表达。其可通过下调机体免疫系统的免疫应答功能及抑制T 细胞活动调控免疫系统，从而对自身耐受起促进作用。虽可预防机体免疫性疾病发生，但也阻碍免疫系统识别杀灭肿瘤细胞。程序性死亡配体-1（programmed deathligand-1，PD-L1）作为PD-1 的配体，多于肿瘤细胞表面存在。肿瘤细胞表面PD-L1 的胞外区与免疫T 细胞表面高表达的PD-1 相结合，通过PD-L1/PD1 通路抑制免疫T 细胞增殖，进一步抑制抗肿瘤免疫应答。另外，研究发现在肿瘤浸润性T细胞（tumor infiltratinglymphocyte，TIL）中PD-1 处于高表达水平。持续存活的肿瘤细胞可抑制PD-1在TIL 中的活化，使肿瘤细胞得以逃避免疫监视，同时能够增强TIL 分泌免疫抑制类炎症细胞因子，对肿瘤细胞的增殖、抗凋亡、迁移等生物学行为起促进作用。目前针对PD-1 研发的药物已广泛应用于肿瘤临床治疗中，明显改善部分患者的生存期[15-16]。

目前针对PD-1 基因SNP 的研究主要集中在肿瘤的遗传易感性方面，而临床工作中制订治疗方案时需考虑不同的临床表型。对肝细胞癌临床表型与该基因SNP 的相关性研究，可为肝细胞癌个体化治疗以及预后判断提供参考，现实价值和应用前景均较高。

本研究分析探讨了PD-1 基因rs10204525、rs2227982、rs36084323 位点SNP 与肝细胞癌临床表型之间的相关性。结果显示，rs36084323 位点CT 基因型患者较野生基因型CC 患者BCLC 分期偏早、门脉侵犯/肝外转移的风险显著减少（P< 0.05），提示携带该基因型的肝细胞癌患者发生肿瘤侵袭转移的可能性相对较小，预后可能更好。rs10204525、rs2227982 位点SNP 与相关临床表型之间无相关性（P> 0.05）。通过检测PD-1 基因rs36084323 位点的不同基因型，可预判肝细胞癌的临床表型，为个体化治疗及判断预后提供参照。本研究虽取得阳性结果，但非大样本研究，且受到多种混杂因素的影响，选择偏倚不可避免。另外，仅对关联性表象进行分析，尚未进一步深入探究其中机制。在今后的临床及科研工作中，将简化检测流程，扩大样本量，进一步研究相关机制，并设法减少干扰因素，以期取得质量更高、说服力更强的研究成果。

综上所述，PD-1 基因SNP 与肝细胞癌临床表型之间存在一定的相关性，检测相关位点基因型对个体化治疗及判断预后具有一定的参考价值。