CXCLs通过免疫浸润对皮肤黑色素瘤患者预后的影响

邵珊珊 黄俊星▲ 张 虎 金红松

1.江苏省泰州市人民医院肿瘤科，江苏泰州 225300；2.江苏省泰州市人民医院急诊外科，江苏泰州 225300

进入21世纪以来，皮肤黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）的发病率以每年3%～5%的速度快速上涨[1]。由于其具有高度的恶性和侵袭性，导致大多数皮肤癌患者病死。SKCM 已成为严重的公共卫生问题[2]，给社会带来巨大的经济负担。因此，寻找合适的预后标志物对提供新的治疗靶点具有重要临床价值。趋化因子是一个大家族的低分子量（8～14 kDa）趋化细胞因子，其与特定受体结合，并在受体细胞中引发定向趋化运动，调节肿瘤细胞的生长和增殖、血管形成、肿瘤干细胞样细胞特性、侵袭和转移[3]，直接和间接地影响肿瘤免疫和癌症进展。CXC 是这个家族的重要成员[4]，肿瘤微环境中的CXC 趋化因子可以调节免疫细胞转运和肿瘤细胞活性，起到抗肿瘤免疫的作用，影响患者预后[5]。然而趋化因子CXC 在SKCM 中的表达水平及对预后的影响尚不清楚。有研究报道了CXC 趋化因子在SKCM 中的表达和功能[6]，但尚不清楚哪种CXC 趋化因子可作为SKCM 预后的生物标志物。本研究将从CXC 趋化因子中寻找可作为SKCM 预后的标志物，并试图揭示其影响SKCM预后的机制。

1 资料与方法

1.1 患者样本

本研究包括两个独立数据集：①肿瘤与癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA），提供了472 位SKCM 患者的转录组信息和临床信息；②组织基因型表达图谱（genotype-tissue expression，GTEx）的正常人转录组信息和临床信息。TCGA 患者特征下载自http://www.portal.gdc.cancer.gov。GTEx 患者特征下载自http://commonfund.nih.gov。

1.2 Oncomine

Oncomine 数据库是肿瘤相关基因研究的数据库，整合了TCGA、基因表达综合数据库（gene expression omnibus data base，GEO）和已发表的文献等来源的RNA 和DNA-seq 数据[7]。在本研究中，利用Oncomine 数据库检索功能，导出17 种CXC趋化因子mRNA 在SKCM 中的表达差异图（设定P-value 阈值为0.05，Fold Change 阈值为2，Gene Rank 阈值为TOP 10%）。

1.3 基因表达谱数据动态分析网站（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）

GEPIA 网站云端包含TCGA 和GTEx 数据库的9736 个肿瘤样本和8587 个正常样本的RNA 测序表达数据[8]。本研究通过使用GEPIA 的“单基因分析”功能来分析16 种CXC 趋化因子在SKCM肿瘤组织和正常组织中的表达差异及在SKCM 不同病理分期的表达情况。利用“生存分析”模块分析16 种CXC 趋化因子表达水平对SKCM 患者预后的影响。筛选出与临床病理分期和预后相关的CXC 家族基因。

1.4 TISIDB

TISIDB 是肿瘤免疫相关数据的数据库，囊括2530 种出版物中的4176 条记录，记录了988 个与抗肿瘤免疫相关的基因、高通量筛选和基因组图谱数据结合分析与T 细胞杀伤或免疫治疗相关的基因[9]。本研究中通过TISIDB 网站分析筛选CXC 家族基因与肿瘤浸润淋巴结细胞的相关性，分析肿瘤免疫特征。

1.5 Cibersort

Cibersort 是基于线性支持向量回归原理对免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的工具，可用RNA-Seq 的数据来估计SKCM 组织中免疫细胞浸润的相对丰度[10]。然后利用R 语言的Limma 包进行差异分析，根据筛选出的CXC 家族基因表达的高低将SKCM 样本分组，比较不同表达组织中的免疫浸润差异。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA 是可下载后免费使用的全基因组表达谱芯片数据分析工具。本研究利用LinkedOnmic 网站模块[11]，对筛选出的CXC 家族基因的相关基因进行GSEA 富集分析，研究该基因主要影响哪些免疫功能通路。

1.7 统计学分析

使用R 语言（v4.0.0）和相应的R 软件包进行统计分析，连续变量分析采用Studentt检验，进行Spearman 相关分析，P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXC趋化因子在SKCM中的差异表达

利用Oncomine 数据库分析16 种CXC 趋化因子在SKCM 中的表达（图1）。结果显示，与正常皮肤组织相比，SKCM 患者的CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10 转录水平显著上调。CXCL12、CXCL14 转录水平显著下调。CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL11、CXCL13、CXCL16、CXCL17 的转录水平无明显差异。

通过GEPIA 数据库分析了16 种CXC 趋化因子在SKCM 患者和正常皮肤组织中的表达差异（图2），结果表明，与正常皮肤组织相比，CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在肿瘤组织中高表达，差异有统计学意义（P< 0.05），CXCL12、CXCL14 在正常皮肤组织中高表达，差异有统计学意义（P< 0.05），CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL16、CXCL17 的表达差异无统计学意义（P> 0.05）。

2.2 CXC趋化因子与SKCM患者病理分期的关系

通过GEPIA 对CXC 趋化因子与SKCM 患者的病理分期相关性进行单因素方差分析，结果显示，CXCL4（F=2.620，P=0.035）、CXCL9（F=6.180，P=0.000）、CXCL10（F=6.010，P=0.000）、CXCL11（F=4.950，P=0.000）、CXCL12（F=3.370，P=0.010）、CXCL13（F=4.830，P=0.001）与SKCM 的病理分期显著相关，差异有统计学意义（P< 0.05），见图3。CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表达促进SKCM 的进展。因此，本研究结果提示CXC 趋化因子与SKCM 的病理过程密切相关。

2.3 CXC趋化因子对SKCM患者预后的影响

利用GEPIA 数据库分析16 种CXC 趋化因子与SKCM 患者预后的关系，热图（图4A）显示了不同CXC 趋化因子的对数比例（log10）。下方和上方（原图中分别为蓝色和红色）分别表示风险较高和较低。带有框架的矩形意味着显著相关。结果表明，CXCL4（P=0.003）、CXCL9（P=0.000）、CXCL10（P=0.007）、CXCL11（P=0.006）、CXCL13（P=0.008）、CXCL16（P=0.016） 与SKCM 患 者预后显著相关。其中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 在SKCM 中是低风险基因，CXCL4 是高风险基因。同时使用GEPIA Survival Analysis 模块，分别对CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 与SKCM 总生存期（overall survival，OS）的关系进行Log-Rank 分析，结果表明（图4B），CXCL4（χ2=14.401，P=0.003）低表达的SKCM 患者有更好的OS，CXCL9（χ2=27.887，P=0.000）、CXCL10（χ2=32.733，P=0.000）、CXCL11（χ2=27.194，P=0.000）、CXCL13（χ2=29.958，P=0.000）、CXCL16（χ2=10.819，P=0.004）高表达的SKCM 患者有更好的OS，差异有统计学意义（P< 0.05）。见图4C～G。

综合以上结果，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在SKCM 患者肿瘤组织中高表达，同时又是SKCM 患者预后的低风险基因，即在肿瘤组织中高表达的基因提示预后较好。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能具有潜在的抗肿瘤作用。因此，后续将研究这4 种CXC 趋化因子是通过何种途径影响SKCM 患者预后的。

2.4 CXC趋化因子与免疫细胞浸润的关系

CXCL 家族基因为趋化因子，势必会影响肿瘤免疫细胞的浸润。首先在TISIDB 网站采用Spearman 相关检验，分别研究SKCM 患者中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可 能 调 控哪些类型的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）。结果表明，这四种基因与ACT CD8+T、Tem CD8、ACT CD4+T、Tfh、Th1、ACT B、Lmm B、NK 细胞、NKT 细胞、巨噬细胞在SKCM 中呈正相关（图5、表1）。

表1 趋化因子与免疫浸润细胞Spearman相关系数列表

运用CIBERSORT 算法计算每位SKCM 患者的22 种免疫细胞丰度，验证根据CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 基因表达模式确定的SKCM 患者在高表达组和低表达组中肿瘤免疫微环境的差异状态。结果表明，浆细胞、幼稚B 细胞、Tfh 细胞、巨噬细胞M1、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、活化的NK 细胞等抗肿瘤免疫细胞在CXC 趋化因子高表达的患者中浸润更高，差异有统计学意义（P< 0.05），见图6。

2.5 CXC趋化因子的生物过程分析

用LinkedOmic 网络工具对CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 及其相互作用密切的基因进行GSEA 富集分析，以明确其主要影响的生物过程。结果显示，炎症反应、免疫反应、细胞因子介导的信号通路、白细胞趋化性以及细胞对干扰素、白细胞介素和肿瘤坏死因子的反应与SKCM 的发生和发展有关。KEGG 信号通路分析结果显示，CXC 趋化因子及其相关基因的功能主要集中在趋化因子结合、趋化因子信号通路、细胞因子-受体相互作用、TNF 信号通路、NK 细胞介导的细胞毒性。提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 与SKCM 的抗肿瘤免疫力相关。见图7。以上结果表明，CXC 趋化因子影响SKCM 患者的预后可能与CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 介导的肿瘤免疫浸润相关。

3 讨论

SKCM 是最常见的黑色素瘤类型，占所有黑色素瘤病例的91.2%[12]，为侵袭性皮肤癌，是造成皮肤癌患者病死的主要原因[13]。近年来，肿瘤免疫检查点抑制剂在SKCM 的治疗中已经显示出显著的临床效果，然而，大部分SKCM 患者免疫治疗的总体应答率仍有待提高。因此，寻找SKCM 预后特征，对SKCM 患者预后进行分层并制订精确的个体化治疗方案显得尤为重要。

趋化因子是组织内协调免疫细胞迁移和定位的一种微小的蛋白质分子[14]，其与特定受体结合，是诱导趋化性、促进免疫细胞分化和导致组织外渗的重要分子。在肿瘤微环境中，趋化因子为促进免疫细胞进入肿瘤微环境提供了丰富的“土壤”[15]，分为五个主要家族：CXC、CC、CX3C、XC 和CX，其中CXC 趋化因子在家族中占有重要地位。CXC 趋化因子及其受体在多种细胞中均有表达，能促进血管生成以及肿瘤细胞增殖、存活和扩散[16]。然而，关于CXC 趋化因子在SKCM 中的表达及预后研究却很少。

本研究应用Oncomine 数据库和GEPIA 数据库对16 种CXC 趋化因子mRNA 进行分析。研究结果显示，8 种CXC 趋化因子（CXCL1、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14）在SKCM 患者肿瘤组织和正常组织中的表达差异有统计学意义（P< 0.05），其中CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13 高表达促进SKCM 的进展。提示CXC 趋化因子可能与SKCM 的病理过程密切相关。有研究指出，CXCL1通过激活VEGF 途径促进黑色素瘤细胞的存活、侵袭和增殖[17]。CXCL8 通过维持内皮细胞的增殖和活性促进肿瘤血管生成[18]。CXCL9、CXCL10、CXCL13 通过增强肿瘤血管的通透性促进黑色素瘤的转移[19]，也可通过抑制T 细胞介导的免疫反应导致肿瘤生长率增加[20]。而CXCL11 在各种人类癌症的致癌过程中均起到调控作用[21]。以上研究与本研究的数据挖掘结果相吻合。

通过进一步分析CXC 趋化因子与生存率之间的关系，发现CXCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL16 表达与SKCM 患者OS 密切相关，有研究表明，血小板水平高的患者比CD8+T 细胞水平高和血小板水平低的患者更容易发生转移，其总体生存率低，而CXCL4 由血小板产生，当CD8+T细胞和血小板之间的平衡被破坏时，CXCL4 可通过抑制CD8+T 细胞功能而影响预后[22]。CXCL9、CXCL10、CXCL11 有几个相似的特征，其在生物结构和生物功能方面表现出相同的特性，在膀胱癌中可通过招募表达CXCR3 的T 淋巴细胞或通过抑制血管生成而具有有效的抗肿瘤特性[23]。CXCL10 的表达可吸引CTL 进入ESCC 组织，并可能对患者生存起到积极作用[24]，以上研究也验证了本研究的数据分析结果。

需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 在肿瘤组织中高表达，同时又是预后的低风险因素，提示CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是SKCM 的重要基因，可能具有某些潜在的抗肿瘤作用。众所周知，趋化因子是介导免疫细胞趋化和淋巴组织发育的趋化性细胞因子，那么这些趋化因子势必会影响肿瘤浸润免疫细胞。CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 影响肿瘤预后的途径可能与其相关。在TISIDB 网站分别研究泛癌中CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 可能调控的肿瘤浸润免疫细胞类型。结果表明，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 与抗肿瘤免疫细胞数量呈正相关。运用ciBersort 算法计算出每位SKCM患者的22 种免疫细胞丰度，在高表达CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 的患者中，B 细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞等抗肿瘤免疫细胞浸润更高，这可能与更佳的预后相关。

综上所述，本研究主要确定了4 个CXC 趋化因子成员（CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13），为SKCM 肿瘤发生和发展的重要生物标志物，其表达水平与预后和免疫浸润密切相关。需要注意的是，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 有共同的受体CXCR3，因此，CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13 是否通过CXCR3 轴来实现免疫调节尚需进一步验证。