贻贝多糖对高脂饮食诱导的载脂蛋白E基因敲除小鼠非酒精性脂肪肝的改善作用

于温温，张金华，刘云娜,3，刘 飞，邵华荣,4, ，韩冠英

（1.锦州医科大学药学院，辽宁锦州 121000；2.山东省药学科学院生物药物重点实验室，山东济南 250101；3.山东大学齐鲁医学院药学院，山东济南 250012；4.厦门大学深圳研究院，广东深圳 518057）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）正迅速成为世界范围内最常见的慢性肝病之一，是造成肝脏相关疾病死亡率和发病率增加的重要原因[1]，NAFLD是在未过度饮酒或无其他致病病因（包括自身免疫性、药物性或病毒性肝炎）情况下的一种代谢性肝损伤，肝细胞内脂肪积累大于5%，其组织学变化可从脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化和肝硬化[2]。据报道，肥胖患者中NAFLD患病率高达90%，且随着相关代谢综合征及肥胖的全球化，NAFLD患病率持续升高，全球亟待关注[3]，控制体重、加强运动和改变饮食等多种办法已被用于改善NAFLD，然而，在实际生活中，对于大多数患者来说，这些方法通常难以坚持。一些药物如他汀类药物和噻唑烷二酮类药物等已在临床试验中进行了测试，但很少有药物在最大限度地提高疗效和减少不良反应方面产生令人满意的结果[4]。因此，开发一种保护肝脏、改善NAFLD的天然功能食品仍是当务之急。

NAFLD的发生、发展与甘油三脂（triglyceride，TG）的合成和降解的不平衡密切相关，既往研究发现，法尼酯受体（farnesoid X receptor，FXR）的激活可通过调节与脂质代谢相关的蛋白来降低甘油三酯水平[5]。FXR作为胆汁激活的核受体在调节胆汁酸、脂质和碳水化合物代谢中起着关键作用[6]。有报道称FXR在NAFLD患者中表达降低，作为脂质代谢的关键调控转录因子，有望成为治疗NAFLD的新靶点[7]。激活FXR可抑制固醇调节元件结合蛋白-1C（sterol regulatory element-binding protein，SREBP-1C）及其靶酶的表达，从而减少肝脂肪变性[8]。SREBP-1C是一种脂肪生成的转录调控因子，SREBP-1C的激活可促进脂肪酸的合成，加速TG的积累，因此，SREBP-1C在代谢性疾病，特别是NAFLD中发挥着重要作用[8]，下调SREBP-1C及其相关的信号分子，如脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS），可抑制脂肪从头生成[9]。有研究表明抑制FAS的表达在肝脂肪变性的治疗中占有重要地位[10]，且有研究发现通过上调FXR，可降低SREBP-1C和FAS水平，对肝脏脂质积累有抑制作用[11]。因此，关注对FXRSREBP-1C-FAS信号调控脂代谢的影响对研究NAFLD的改善方法具有重要意义。

贻贝多糖（mussel polysaccharideα-D-Glucan，MP-A）是本课题组由海洋贻贝中分离提取到的一种新型多糖，主体为葡聚糖，含葡萄糖分枝，重均分子量在1200～1300 kDa之间[12-13]。前期研究表明，MPA对高脂饮食诱导的大鼠血脂水平和NAFLD具有改善作用[14]，基于NAFLD与脂质代谢的紊乱和胆固醇代谢密切相关，在前期研究基础上，本研究以高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠NAFLD模型，探讨MP-A对NAFLD脂代谢和胆固醇代谢密切相关的蛋白分子信号FXR-SREBP-1C-FAS信号通路和CYP7A1受体表达的调节作用，旨在为MP-A开发为改善NAFLD的天然功能食品提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

20只C57BL/6J正常小鼠和20只ApoE-/-小鼠（6～8周龄） 雄性，体重20～23 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证：SCXK（京）2016-0006；MP-A（纯度98.65%，w/w） 山东省药学科学院提供；TG检测试剂盒（批号：20210510） 南京建成生物公司研究所；高脂样本总胆固醇（TC）酶法测定试剂盒（批号：E1026） 北京普利莱基因技术有限公司；NR1H4 polyclonal antibody（批号：25055-1-AP）、FAS polyclonal antibody（批号：10624-2-AP）

Proteintech有限公司；Anti-SREBP1 antibody（批号：H00425） 购自华安生物有限公司；Anti-CYP7A1 antibody（批号：ab65596） Abcam公司；FAS、CYP7A1、FXR、小异源二聚体伴侣受体（small heterodimer partner，SHP）、GAPDH基因扩增引物 由武汉赛维尔生物科技有限公司设计并合成；HRP-羊抗兔1gG（批号：BST15J26C15J54）、HRP-羊抗小鼠2gG（批号：BST16C15B16G50） 博士德生物工程有限公司；BeyoGel™ Plus PAGE预制胶（Tris-gly，10%，10孔）（批号：90221211014）、BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准（6.5-270 kDa）（批号：90071）、一抗稀释液（批号：12621210412） 碧云天生物有限公司；脱脂奶粉（批号：414WO511） 索莱宝生物有限公司；蛋白定量BCA试剂盒（批号：7E412I0）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mi（批号：7E501C1）

诺唯赞有限公司。

冷冻型微量台式离心机、QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪 美国Thermo公司；电泳仪ProXima 280化学发光成像系统、 美国Bio-Rad公司；Nano-100超微量核酸分析仪 杭州奥盛仪器有限公司；Infinite M200PRO多功能酶标仪 瑞士TECAN公司；6325XQ601089梯度PCR仪 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MP-A溶液配制 称取MP-A 0.8 g，加蒸馏水溶解至10 mL，得浓度为80 mg/mL的MP-A灌胃溶液，并依据前期预实验研究结果，确定0.8 g/kg作为本研究MP-A的小鼠灌胃给药剂量。

1.2.2 动物实验分组与处理 经山东省药学科学院实验动物管理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC）批准，开展本研究动物试验。所有小鼠适应性饲养7 d，20只C57BL/6J正常小鼠随机分为两组：正常组、正常+MP-A组，20只ApoE-/-小鼠随机分为两组：模型组、模型+MPA组，每组10只动物。

正常组和正常+MP-A组给予基础饲料喂养，模型组和模型+MP-A组给予高脂饲料（10.0%猪油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黄粉、0.5%胆酸钠和59.5%常规饲料）[15]喂养。

从第2周开始，正常+MP-A组、模型+MP-A组灌胃给予MP-A（0.8 g/kg），根据小鼠体重每天灌胃1次，持续7周，每周对小鼠进行称重，调整灌胃体积，正常组和模型组灌胃对应体积的蒸馏水。实验结束后，称量小鼠体重，各组小鼠用1%戊巴比妥溶液（30 mg/kg）麻醉。小鼠眼球摘除后取血，对各组小鼠解剖，肝脏完整取出，肝脏表面使用生理盐水冲洗，病理切片盒中放入同等部位的部分肝脏，采用4%多聚甲醛溶液中固定，后续进行切片染色观察[16]，其余肝脏置于-80 ℃保存备用。

1.2.3 血脂水平测定 小鼠眼球摘除取血，血液静置2 h后4000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，测定血清 TG、TC水平。

1.2.4 肝脏中TG含量的测定 准确称取肝脏组织，按重量（g）:体积（mL）=1:9比例，加入9倍体积无水乙醇，冰水浴条件下机械匀浆，2500 r/min，离心10 min，取上清液待测。按参考文献[17]及试剂盒说明书检测肝脏TG含量。

1.2.5 肝脏中TC含量的测定 按照试剂盒说明书操作，准确称取肝脏组织，按肝脏重量（mg）:体积（μL）=1:10比例，加入试剂盒中的裂解液，用高通量组织匀浆器破碎肝脏组织，静置10 min，取适量上清液转移至1.5 mL离心管，余下的上清液用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白含量测定。70 ℃加热10 min，室温2000 r/min离心5 min，取上清液用于酶学测定。配制工作液，按4:1比例取试剂盒中的R1与R2混匀。将5 mmol/L胆固醇标准品用无水乙醇稀释为2500、1250、625、312.5 μmol/L[18]。向96孔板中加入190 μL反应液，再加入10 μL空白对照液、标准品、上清液，充分混匀。37 ℃反应20 min，将96孔板置于酶标仪中，在550 nm波长处测定OD值[19]，以测定的蛋白浓度校正胆固醇含量。

1.2.6 肝脏组织病理学检查 取固定于多聚甲醛中的肝脏标本，嵌入石蜡，切割成5 μm厚的切片，H&E染料染色后于光学显微镜下进行观察。

1.2.7 RT-qPCR法检测小鼠肝组织中FXR、SHP、CYP7A1、FAS的mRNA表达水平 采用mRNA提取试剂盒从肝脏样本中分离总RNA。采用NANO DROP 2000仪器，测定OD260/OD280比值，对RNA进行定量和质量评估[20]。配制逆转录体系，进行逆转录实验，设计用于RT-qPCR扩增的引物（见表1），配制扩增体系，进行PCR扩增。以GAPDH作为内参基因，2-ΔΔCt法分析各组之间目的基因的转录水平。

表1 RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Prime sequences for RT-qPCR analysis

1.2.8 Western blot法检测小鼠肝组织FXR、SREBP-1C 、FAS、CYP7A1蛋白表达水平 称取肝脏样本，加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解缓冲液，冰上裂解30 min，12000 r/min离心10 min。收集样本蛋白，BCA试剂盒检测蛋白质浓度，各组蛋白样本定量，SDS-PAGE电泳后转膜，封闭液封闭[21]，一抗孵育，置于摇床上4 ℃过夜，第2 d，与二抗孵育，TBST洗膜三次，ECL显影液显影。用Image J软件分析条带，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.3 数据处理

所有数据均用平均值±标准误（Mean±SEM）表示，采用GraphPad prism 8.0.1软件进行数据分析，One-way ANOVA方差分析用于组间样本差异性比较，P＜0.05提示差异具有统计学意义，P＜0.01提示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 MP-A对ApoE-/-小鼠体重的影响

体重及体重增长率结果如表2所示，与正常组比较，高脂饮食诱导的模型组小鼠体重及体重增长率显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，模型+MP-A组小鼠体重增长率显著降低（P＜0.05），表明MP-A能减缓高脂饮食所致NAFLD小鼠体重增加，且正常动物给予MP-A对体重无显著影响（P＞0.05）。

2.2 MP-A对ApoE-/-小鼠血脂水平的影响

由表2可知，小鼠长期高脂饮食喂养后，与正常组相比，模型组小鼠血清中TG、TC水平极显著分别升高0.66 mmol/L（P＜0.01）和5.53 mmol/L（P＜0.01）。给予MP-A灌胃7周后，与模型组比较，模型+MP-A组小鼠血清TG水平极显著降低0.59 mmol/L（P＜0.01），而TC水平尽管由（7.10±0.30） mmol/L降至（5.95±0.46） mmol/L，但统计学分析结果显示无显著意义（P＞0.05）。结果表明MP-A可明显降低高脂饮食诱导的血清TG水平升高。

表2 MP-A对ApoE-/-小鼠体重及血脂水平的影响Table 2 Effects of MP-A on body weight and serum lipid levels in ApoE-/-mice

2.3 MP-A对小鼠肝脏总量及肝脏TG、TC水平的影响

由表3可知，相比正常组，模型小鼠在长期高脂饮食诱导下，肝脏重量、肝脏指数、肝脏TG、TC水平分别升高1.2 g，4.32%，38.02、43.97 μmol/g prot，差异极显著（P＜0.01），说明高脂饮食可导致肝脏脂质沉积。而连续7周给予MP-A，模型+MP-A组小鼠肝脏重量由（2.21±0.26） g降低到（1.20±0.04） g、肝脏指数降低了3.6%、肝脏TG水平降低了32.26 μmol/g prot，差异均有统计学意义（P＜0.05），肝脏TC水平降低至（32.30±2.76） μmol/g prot，差异有统计学意义（P＜0.05）。肝脏TG水平与血清中TG水平趋势相比一致且肝脏TC水平明显降低。结果表明MPA能抑制高脂饮食诱导的肝内TG、TC沉积。

表3 MP-A对各组小鼠肝脏总量及TG、TC水平的影响Table 3 Effects of MP-A on the total amount of liver as well as the liver TG and TC levels of each group

2.4 MP-A可改善肝脂肪变性

如图1肝组织H&E染色显示，与正常组比较，模型组小鼠肝脏可见大小不均的脂质液泡弥散分布，存在显著的肝脏脂肪变性。小鼠灌胃MP-A后，模型+MP-A组小鼠脂质液泡个数变少，肝细胞微泡脂肪变化程度减轻。病理结果证实，高脂饮食喂养会诱导ApoE-/-小鼠肝脏脂质积累，给予MP-A，可显著改善肝脏脂肪变性。

图1 小鼠肝脏切片的H&E染色的代表性显微照片Fig.1 Representative photomicrograph of H&E staining of mouse liver slices

2.5 MP-A对肝脏中FXR、SHP、FAS和CYP7A1 mRNA水平的影响

如图2a～图2d所示，与正常组相比较，模型组的肝脏FASmRNA表达水平极显著上升（P＜0.01），CYP7A1mRNA表达水平显著下降（P＜0.05），FXR、SHP的mRNA表达水平无显著变化（P＞0.05）。与模型组比较，模型+MP-A组FASmRNA表达水平显著下降（P＜0.05），CYP7A1mRNA表达水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），FXR及SHP的表达水平无显著影响（P＞0.05）。因此推测模型+MP-A组中血清和肝脏中TG的降低可能与FASmRNA的表达下调有关。

图2 各组肝组织中FXR、SHP、FAS和CYP7A1 mRNA水平Fig.2 Analysis of the FXR, SHP, FAS and CYP7A1 mRNA levels in liver tissues

2.6 小鼠肝组织中FXR、SREBP-1C、FAS、和CYP7A1的蛋白表达水平

为进一步研究MP-A在NAFLD中作用的信号通路，本文评估了肝组织中与脂质代谢和胆固醇代谢密切相关的蛋白分子表达。如图3a～图3e所示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织中FXR和CYP7A1的蛋白表达水平显著下降（P＜0.05，P＜0.01），SREBP-1C、FAS的蛋白表达水平显著上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，模型+MP-A组中FXR、CYP7A1的蛋白表达水平显著上升（P＜0.05），SREBP-1C、FAS蛋白表达水平显著下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，MP-A干预可影响FXR-SREBP-1C-FAS信号通路和CYP7A1的蛋白表达，调节脂代谢和胆固醇代谢。

图3 各组肝脏组织中FXR、SREBP-1C、FAS和CYP7A1的蛋白表达水平Fig.3 Protein expression levels of FXR, SREBP-1C, FAS and CYP7A1 in liver tissues of each group

3 讨论与结论

NAFLD是目前最常见的慢性肝病[22]，约30%的NAFLD患者会发展为非酒精性脂肪肝炎[23]，若不及时预防，极易发展为肝硬化、肝癌，因此发掘新的天然功能性食品改善NAFLD是很有必要的。有研究报道喂养高脂饮食的ApoE-/-小鼠可作为快速而有价值的NAFLD模型[24]，高脂饮食喂养的动物可以复制人类NAFLD中的主要组织病变和发病机制，长期高脂饮食喂养会使小鼠肥胖且出现肝脂肪变性[25]。同样张虹等通过高脂饮食组的小鼠体重、肝重明显增加，肝细胞呈脂肪变性，肝脏TG水平显著升高等结果表明成功构建小鼠NAFLD动物模型[26]。本实验模型组小鼠精神不振，皮毛粗糙，体型肥大，体重较正常组显著升高，连续7周喂养高脂饮食，模型组小鼠体重增长率、肝重、肝脏指数较正常组显著升高，且血清TG、TC水平也显著上升。H&E染色观察模型组小鼠肝脏有明显的脂肪变性，与NAFLD患者的临床表现相似[27]。肝脏TG、TC的水平明显升高，成功构建ApoE-/-小鼠NAFLD模型。

MP-A是课题组由贻贝中提取到的一种具备新颖结构的新型多糖[28]，并发现MP-A具有调血脂和保肝护肝活性[20]，但将其进一步作为功能食品开发，相关研究亟需深入。在本研究中，采用ApoE-/-小鼠验证了MP-A对高脂诱导的NAFLD改善作用，发现MP-A干预可显著降低ApoE-/-模型小鼠体重增长率、血清TG、肝脏重量及肝脏TG、TC水平。肝脏组织形态学观察结果中显示模型组出现明显的肝脂肪变性，且有明显的脂肪空泡症状，而给予MP-A，小鼠肝组织的病变症状明显改善。本研究采用ApoE-/-小鼠NAFLD模型进一步确证了MP-A对NAFLD具有显著的改善作用。

近年研究也表明，除胰岛素抵抗、肥胖、2型糖尿病、氧化应激、脂肪失衡等因素外，肝游离胆固醇的积累和肝内胆固醇稳态的破坏与NAFLD的发病机制密切相关[29]。肝细胞胆固醇稳态是通过多种机制维持的，包括细胞合成、摄取、储存、排出和排泄。肝脏不仅是合成胆固醇的重要器官，也是输出胆固醇的器官。肝脏胆固醇输出是维持肝脏胆固醇稳态所必需的[30]，由胆固醇合成胆汁酸是肝脏胆固醇分解代谢的主要途径。肝CYP7A1催化反应是胆汁酸合成的速率限制步骤[31]，多项研究[16,32-34]发现诱导肝脏CYP7A1过表达可预防高脂饮食诱导的肥胖、脂肪肝和胰岛素抵抗，改善肝脏脂质积累。本研究结果显示，MP-A干预可上调CYP7A1的mRNA水平和蛋白水平，CYP7A1表达水平升高加快胆固醇转化为胆汁酸，消耗肝脏中的胆固醇，且MP-A干预后肝脏TC水平显著降低。因此，MP-A可能对高脂饮食诱导的肝内胆固醇代谢有一定的调节作用。

胆汁酸在体内作为一种信号分子，可激活FXR受体调控机体代谢[35]，FXR在脂质代谢的调节中起着重要的作用[36]，激活肝脏FXR受体相应途径可抑制NAFLD[37]。FXR激活后可通过上调SHP的表达，调控SHP，影响SREBP-1、ACC和FAS间接调控脂肪的生成，抑制脂质沉积[6,38-39]。SREBP-1C在肝脏中高表达[40]，是调节肝脏脂质代谢，尤其是肝脏和脂肪组织中TG沉积的关键转录因子[41]。FXRSREBP-1C-FAS信号通路调控脂代谢在NAFLD发生发展过程中具有重要作用，通过FXR-SHP-SREBP-1C途径降低肝脏新生脂肪是改善肝脂肪变性的机制之一[41]。而FAS为脂肪酸合成酶，FAS异常表达可促进肝细胞内脂质大量堆积，诱导肝组织氧化损伤，导致机体脂代谢及能量代谢紊乱[42]。本研究发现，高脂饮食会诱导小鼠肝脏TG大量累积，SREBP-1C、FAS的蛋白过度表达，抑制FXR的蛋白表达，MPA干预可上调FXR蛋白表达，下调SREBP- 1C、 FAS的蛋白表达，减轻小鼠肝脏脂肪积累。表明MPA干预可影响FXR-SREBP-1C-FAS信号通路，调控脂代谢，逆转肝脏TG 堆积，具有显著的降脂作用。

综上所述，MP-A可影响肝脏脂质代谢密切相关的FXR-SREBP-1C-FAS信号通路和CYP7A1的表达，抑制高脂饮食诱导的肝脏TG积累及组织病理改变，对NAFLD及肝脏代谢性疾病的防治具有重要的应用前景。目前本研究确证了MP-A与脂代谢和胆固醇代谢相关的蛋白信号有关，但尚未确定MPA是直接或间接影响了肝脏中这些关键的蛋白信号分子，深入的研究仍在开展。本研究揭示了MPA的降血脂作用，为降血脂功能性食品的开发以及NAFLD的防治提供重要的理论依据。