Fe3O4纳米酶对潜指印中物质信息的可视化识别

黄 锐, 周 毅

(1.西南政法大学刑事侦查学院,重庆 401120;2.重庆高校物证技术工程研究中心,重庆 401120;3.重庆高校刑事技术重点实验室,重庆 401120)

0 引言

汗潜指印(潜指印),即通过手指汗孔分泌的汗液在载体上形成的实际存在而裸眼不易见的指印,是犯罪现场和日常生活中“常见”的指印遗留形态。汗液作为人体的重要代谢产物,包含了诸多代谢物质[1];根据洛卡德物质交换原理,指印中保留了接触物的信息,即“触物留痕”[2]。这两个因素使得无处不在的潜指印不仅包含了认定遗留人身份的指纹二维形态信息,还隐藏了更高维的物质信息。在显现潜指印形态的同时,挖掘其中的物质信息可进一步推断更多的个体信息,如指印遗留时间、指印遗留人是否患病等[3]。另外,当指印纹线模糊残缺时,对其中物质信息的挖掘具有重要意义。

潜指印中的物质分为外源性物质、内源性物质、半内源性物质[4]。外源性物质为“触物留痕”所产生的指印中本身不存在的残留物;内源性物质为指尖汗液中自然的分泌物;半内源性物质为吸食香烟、毒物或药物等后指尖皮肤异常分泌的代谢物。对指印中物质成分的挖掘主要集中在外源性和半内源性物质,如Lees H等人对不同载体上指印中10种爆炸残留物进行了定性和定量分析[5];其中内源性物质多是用于保证指印纹线的显现和指印遗留时间的推断,如Xu等人以指印中内源的蛋白质/多肽分泌物为基础,研究了指印化学成像和模式识别的交叉融合[6];Girod等人使用傅里叶变换红外光谱(FTIR)研究了指印遗留时间[7]。然而,现有的关于指印中物质信息挖掘的技术方法多是借助大型仪器,如光谱法、质谱法、电化学法等[3],这些技术虽然准确度和灵敏度较高,但其技术成本高、操作流程相对复杂,使其大多滞留于科研试验,并未给侦查实践带来实质性的提升。因此,亟需开发出一种低成本、高效率的指印物质信息识别技术。

2007年,我国科学家首次发现无机材料Fe3O4在纳米尺度呈现出类似天然酶——辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的生物活性,其催化效率与天然酶相近,并首次提出纳米酶的概念[8]。纳米酶是一类既有纳米材料理化特性,又蕴含酶学催化功能的新一代人工模拟酶。与传统的模拟酶相比,纳米酶具有更高的催化效率,其还具备对热、酸和碱的稳定性,可规模化制备,价格较低等优点[8-9]。在指纹成像领域,纳米Fe3O4因其无毒、表面易于修饰且具有超顺磁性,许多研究者将其功能化形成磁性荧光纳米材料,应用于犯罪现场潜指印的显现,取得良好的效果[10-11]。

然而,现有的将纳米Fe3O4相关材料应用于指纹成像的研究中,只运用了超顺磁性,未曾运用其纳米酶催化特性。因此,利用材料的多重特性来降低指印物质识别的成本或许是一种可行途径。同时,借助计算机识别进一步提升识别效率,特别是当肉眼难以辨别是否产生颜色变化时,其具有更大的优势。HSV、RGB和灰度,是不同的表达色彩的颜色空间(色彩空间)[12-14],将其应用于对潜指印物质颜色的分析,有助于对识别效率和准确率的提升。H2O2既是外源性物质的产物,又是内源性物质的产物。作为过氧化炸药爆炸后的残留物,对H2O2进行快速检测能为案件提供更多的线索与物证[15];同时H2O2还是汗液分泌物中葡萄糖、乳酸、尿素等的中间产物,这些分泌物与人体疾病,如糖尿病、癌症、风湿病等息息相关[16-17]。

因此,本文以H2O2为突破口,协同纳米酶Fe3O4的超顺磁性和辣根过氧化物酶样活性,并在Matlab中设计和运用HSV、RGB和灰度程序对潜指印图像进行分析,实现了对潜指印二维形态的显现及其中H2O2的定性与半定量分析,并初步实现了葡萄糖的定性分析,提供了一种低门槛、高效率的潜指印物质识别新方法和新思路,流程如图1所示。

图1 整体流程示意图

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、氯化高铁(FeCl3·6H2O)、无水乙醇(C2H5OH)、过氧化氢(H2O2,30wt%)、冰醋酸(CH3COOH)、醋酸钠(CH3COONa)、PBS缓冲液、四甲基联苯胺(TMB)、葡萄糖(D-Glucose)、葡萄糖氧化酶(GOx,180 U/mg)均购于上海阿拉丁生化科技有限公司;所有化学试剂为分析纯,实验中所用水均为超纯水。

Milli-Q超纯水机(美国密理博公司);pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);JP-040超声仪(上海精宏实验设备有限公司);ESJ200-4B分析天平(沈阳龙腾电子有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海申贤恒温厂);TG16B台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);Thermo-Fisher DXR2拉曼光谱仪(美国赛默飞)。

1.2 潜指印中H2O2的原位可视化方法

志愿者将手洗净并用纸巾擦干,用指尖擦过额头,收集一些皮脂,然后用指尖蘸取H2O2溶液(5×102mM)。将指尖和拇指揉搓,使该物质与指尖上的皮脂混合。在载玻片上捺印指印,获得汗潜指印样本。用我们之前的方法[11]合成纳米Fe3O4,将Fe3O4与TMB按质量比1∶1混合并充分研磨。

“抖显+喷显”分为两步:抖显:用磁性刷吸取研磨好的混合粉末,并将其至于载玻片指印外侧,通过抖动使得混合粉末从载玻片一端经过潜指印落向另一端,用磁性刷将多余的粉末吸走,在白色背景下拍照取样a。喷显:将HAc-NaAc缓冲液(pH3.2)超声5 min。取1 mL缓冲液装入喷雾器中,用喷雾器朝指印a喷显,喷完即止,4 min后在白色背景下拍照取样b。其中拍照的手机、参数、距离、拍照时的角度和背景光照,以及喷显时喷雾器及其高度和角度保持一致。

1.3 原位可视化条件的优化

保证其他条件一致,将TMB与纳米Fe3O4分别按质量比10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的比例混合并充分研磨,探究TMB与Fe3O4之间的最优搭配比例;保证其他条件一致,分别将pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.8的HAc-NaAc缓冲液超声5 min,探究原位识别的最优pH值。

1.4 潜指印中H2O2的定性分析

在载玻片上捺印指印,以最优原位识别条件获得“抖显+喷显”指印,并在白色背景下,通过智能手机固定为图像数据。将所得指印图像输入自编代码,分别计算图像每个像素点的HSV数据(色相、饱和度、明度),根据色相值对H2O2进行定性,并用拉曼光谱仪对定性结果加以验证。

1.5 潜指印中H2O2的半定量分析

用手指蘸取不同浓度H2O2溶液(0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),在载玻片上捺印指印,获得相应浓度的“抖显+喷显”指印的图像数据。将其输入自编代码,分别计算出变色前/后每张图像中各个像素点的RGB/灰度值及平均值,进一步计算变色前后图像数据之间的差值(△值),构建图像△RGB、△R、△G、△B和△Gray与H2O2浓度数量级之间的映射关系,实现潜指印上H2O2的半定量分析。

1.6 模拟现场应用及比较

在6种不同材质/颜色的客体进行现场模拟,选取手机充电器、快递盒、纸杯、A4纸、笔记本封面、洗洁精瓶子等生活常见物品作为客体,在这些客体上捺印不同浓度H2O2的潜指印,并进行原位识别,探究本方法的准确性、普适性。同时将本方法和材料与公安民警办案过程中显现指印时常用的磁性粉、金粉、银粉的显现效果进行进一步的比较。

1.7 潜指印中葡萄糖的识别

将手指视为上下两部分,下部蘸取葡萄糖粉末,上部保持正常,在载玻片上捺印指印并抖显。在两部分滴加等量葡萄糖氧化酶溶液,孵育半小时后拍照固定,随后用HSV程序进行定性分析。

2 结果与讨论

2.1 潜指印上H2O2的原位可视化

图2展现了原位可视化的原理和效果。“抖显+喷显”后,纳米Fe3O4优异的超顺磁性使其均匀分布在指印纹线上,同时HAc-NaAc水珠随机分布在指印纹线周围,在水分干燥的过程中产生了咖啡环效应[18-19],即“在液体蒸发过程中,由于毛细管从液体中心向外流动,会将悬浮物带到边缘,直至几乎所有的悬浮物都沉淀下来,使得水珠形成环状”。当水珠里的HAc-NaAc被带到指印纹线边缘时,由于分子表面张力,部分HAc-NaAc和水珠会吸附在指印纹线上的Fe3O4@TMB混合粉末表面。此时,TMB逐渐溶解在HAc-NaAc水珠里,同时指印中的油脂会在水珠表面形成一层水油膜,从而减少水分的蒸发,为TMB、H2O2和纳米Fe3O4的变色反应提供微小的液体环境,使得变色反应能够在指印上(固体表面)顺利进行,且不会破坏其纹线形态。方程式为:

该过程体现了纳米Fe3O4的纳米酶催化特性:第一步,H2O2从纳米Fe3O4颗粒表面的Fe2+获得电子形成H2O,Fe2+被氧化为Fe3+;第二步,TMB(白色)失去电子变为oxTMB(蓝绿色),Fe3+获得电子被还原成Fe2+[20]。由图可知,“抖显+喷显”后指纹的整体颜色从灰黑色变为了蓝绿色,与变色原理相符。指印图像中可观察到多个起点、终点等清晰的指纹二级特征。相较于“抖显+喷显”的方法,“抖显+滴显”的潜指印图像呈糊状,如图2(b),是由于“抖显+滴显”时Fe3O4@TMB混合粉末与指纹乳突纹线属于物理吸附,二者结合不够稳定,大颗粒水滴表面张力大于物理吸附力,水滴在扩散的同时也带着Fe3O4@TMB混合粉末扩散。而“抖显+喷显”的方法成功发挥出了纳米Fe3O4的双重特性,并将水滴雾化解决了大颗粒水滴表面张力带来的破坏,实现了对潜指印上H2O2的原位可视化。

图2 潜指印H2O2原位可视化原理及效果

2.2 条件的优化

为进一步优化原位可视化的效果,探究了原位可视化时TMB与纳米Fe3O4的最优比例搭配,以及最适pH。图3中a1到a7、b1到b7分别是TMB与Fe3O4质量比为10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的“抖显+喷显”之后的指印图像(温度、pH、H2O2浓度一致);c1到c7、d1到d7分别是HAc-NaAc缓冲液pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2和5.8的“抖显+喷显”之后的指印图像(温度、TMB与Fe3O4质量比、H2O2浓度一致)。

图3 原位可视化不同条件的示意图

图3中从a1到a7,由于纳米Fe3O4占比越来越多,指印纹线的颜色由浅至深。而b1到b7对应的颜色变化却并非如此,b1和b2变色前后变色不明显,原因在于a1和a2中纳米Fe3O4的占比低,在变色反应时所提供的催化位点不足;而b6和b7中由于纳米Fe3O4的占比过高,变色后蓝绿色受黑色的干扰较重;在b3、b4、b5中,b3的效果最好,因此TMB与纳米Fe3O4的最优比例为2∶1。

相较于a1到a7,c1到c7的纹线颜色深浅更均匀,但仍然存在一些差异,这是指印捺印时的力度、油脂含量的差异造成的,在可控误差范围之内。与HRP酶相似,纳米Fe3O4过氧化物酶样活性也受溶液pH值的影响。当pH在3.2~3.6范围变化时,纳米Fe3O4的催化活性随pH增大而增强,当pH为3.6时的催化活性最高,此后随着pH值增大其催化活性降低,因此选取3.6为最佳pH,根据已有文献报道[21],在H2O2与TMB的反应过程中,羟基自由基(·OH)的产生发挥了重要作用,而pH值的变化会对该过程产生影响。此现象与溶液中TMB、H2O2和纳米Fe3O4反应的最适pH值一致[8]。此外,本方法对于不同形成时间的潜指印显现效果,在前期的工作中已有探究,结果表明潜指印中残留物会随时间的解吸、电离和汽化,本方法的最佳显现时间应控制在5天之内[22]。

2.3 定性分析

HSV颜色空间对颜色的表达相对于RGB和灰度更符合人类观察色彩的方式。所以用HSV程序来代替肉眼进行定性的判定。此程序是在本课题组之前研究的基础上[7]作出了进一步的优化。图4中(a)和(c)中上下两枚指印分别是变色前/后的指印图像,二维表格是指印图像经HSV程序分析后的色相图,横坐标代表色相(H),纵坐标表示像素点的个数,其中,为便于计算和表达,我们在程序中将HSV模型的色相(H)的范围从(0°~360°)[12]调整为(0~1);(b)和(d)是HSV三维散点图,3个坐标轴分别代表了像素点的色相(H)、饱和度(S)和明度(V),其中小点的颜色直接反映了指印图像像素点的颜色。

图4 指印定性分析图

变色前的指印图像整体偏黄,如色相图(a)显示,该指印图像像素点的色相范围分布在(0.1~0.2)区间,超过10×104的像素点集中在0.12,因此(b)中多数的小点存在重叠现象,肉眼观察到的黄色小点数量较少;变色后的指印图像出现了oxTMB对应的蓝绿色,色相图(c)中显示其像素点的色相范围分布在(0.46~0.52)区间,集中在0.48,但相较于(a)其像素点颜色的分布范围更窄,因此(d)中的颜色小点的在H轴的分布范围相较于(b)也更窄。图(e)中的指印为低浓度H2O2的指印图像,肉眼难以分辨指印中有蓝绿色产生,而从其对应的色相图和三维散点图(f)中可直观地观察到蓝绿色像素点的存在。可见,利用HSV程序将指印的变色情况进行数据化、量化表达,相较于肉眼更为灵敏、客观。

为验证蓝绿色是否由oxTMB产生,图5是对原位可视化前后潜指印中随机5处纹线进行拉曼检测的结果。TMB在被氧化前,在1 189、1 332和1 609 cm-1处存在较强的拉曼峰[23],当其被氧化成oxTMB后拉曼强度会有所下降,因此通过比对变色前后的拉曼强度即可验证。由于本实验对TMB进行拉曼检测时所用载体是载玻片,且TMB表面附有Fe3O4,其拉曼峰有不同程度的偏移(变为1 166、1 345和1 603 cm-1)。图5显示,显色后指印(曲线1~5)的拉曼强度都明显低于显色前(曲线6~10)的强度,与钟丽云等人的实验现象一致[24],因此变色后指印中的蓝绿色是由oxTMB产生,所以根据三维散点图和色相图中的颜色变化即可实现潜指印中H2O2的定性分析。

图5 拉曼验证图

2.4 半定量分析

潜指印中H2O2半定量分析的原理为:

其中“x”表示指印图像的RGB/灰度值。不同浓度H2O2的指印的Δx(变化值)不同,因此计算出各浓度梯度的Δx(变化值)即可实现指印中H2O2的半定量分析。

图6是H2O2的多通道半定量分析图,内嵌图为含有不同浓度数量级H2O2的指印图像。其中,红色、绿色、蓝色、棕橙色、灰色曲线分别代表△R、△G、△B、△RGB、△Gray,横坐标为H2O2浓度的对数(Log),纵坐标为变化值的大小;指印内嵌图分为8行5列,每一行代表不同浓度的H2O2(从下至上H2O2浓度分别为0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),每一行的5个正方块代表同一枚指印的5个不同区域(由于指印图像边缘没有指印纹线,会影响定量的准确性,故以五点取样法,在含有指印纹线的区域随机选取5个区域,用这5个区域的变色情况代表整枚指印的变色情况)。

图6 半定量分析图

图6中,不同△x(变化值)曲线的形态表明,H2O2浓度的对数与△x(变化值)的大小不成正比,二者关系满足于Peak Functions函数中Asym2Sig曲线的分布样式,

其中y0为偏移量;A为振幅;xc为水平方向的中心点;w1,w2,w3为宽度参量,并且w2,w3决定峰值位置[25]。在较低H2O2浓度时(5×10-3mM~5×10-1mM)其催化反应速率缓慢,这是因为纳米Fe3O4对H2O2的亲和力不强;而在较高H2O2浓度时(5×102mM~5×103mM),由于纳米Fe3O4的催化位点不够,多个H2O2分子对Fe3O4上的单个催化位点产生了竞争,而单一催化位点的竞争导致了催化活性的降低。因此,在较高H2O2浓度时,其催化反应速率也逐步减缓,此现象与研究前期在溶液中利用紫外可见光谱测得的数据相符[23],验证了半定量的准确性与科学性。

相对于△G和△B曲线,△R、△RGB和△Gray曲线拟合程度更高,是因为TMB与H2O2的产物颜色呈“蓝绿色”,与绿色通道(△G)和蓝色通道(△B)颜色重合,会影响其准确性。因此在半定量分析时应选择△R、△RGB和△Gray 3个通道,而当潜指印图像的背景存在红色干扰时,应选择△RGB、△Gray通道;另外,由于△RGB是由△R、△G、△B组合而成,其拟合程度会受△G、△B的影响。因此,综合各因素,选取△Gray通道进行半定量分析更为准确。图7(g)为单独的△Gray通道半定量箱线图,其中小写字母(a、b、c、d、e、f、g)表示不同浓度梯度的显著差异(P＜0.05)。

2.5 模拟现场应用及比较

为检验本方法的普适性,在不同材质/不同颜色客体上进行了模拟现场应用,如图7所示。其中a为洗洁精瓶子(其中H2O2的浓度为5×102mM)、b为纸杯(浓度为5×101mM)、c为快递盒(浓度为2×101mM)、d为A4纸(浓度为1×100mM)、e为笔记本封面(浓度为2×10-1mM)、f为手机充电器(浓度为2×10-2mM)。

经过原位可视化识别,可观察到诸多的指印细节,说明“抖显+喷显”的方法适用于多种小体积客体上潜指印的显现。图7中(a1/a2、b1/b2、c1/c2、d1/d2、e1/e2、f1/f2)分别对应6种客体上“变色前”和“变色后”的指印,其中,3种白色背景的差异最大(b1/b2、d1/d2、f1/f2),黄色背景(a1/a2)、棕色背景(c1/c2)的差异稍小,而红色背景(e1/e2)的差异最小。如图7中h与h',变色产生的蓝绿色在红色背景衬托下呈黑色,肉眼难以辨别出有蓝绿色的出现,但从所得的定性图谱中可观察到蓝色像素点的存在,进一步印证了计算机识别相较于肉眼更为灵敏、准确。随后进一步对3种白色背景下指印中H2O2的进行半定量分析(客体分别为b纸杯、d A4纸、f手机充电器),如图7中g所示。其中b、d、f的半定量结果与其测得的浓度与实际浓度相符,半定量结果在误差范围之内。

图7 现场应用图

以载玻片为客体,将本方法和材料与传统的磁性粉、金粉、银粉的潜指印显现效果进行比较。如图8,a为纳米Fe3O4@TMB抖显的潜指印,b,c和d分别为传统磁性粉、银粉、金粉抖显的潜指印,a',b',c'和d'分别是Fe3O4@TMB、传统磁性粉、银粉和金粉“刷显”的潜指印。a1和a'1分别为a和a'中心花纹处的超景深3D放大图像。

图8中通过“抖显”形成的指印图像,Fe3O4@TMB的显现效果(a)最佳,其中脊线与谷线对比明显,说明Fe3O4@TMB对潜指印纹线具有较高的选择性。由于传统的磁性粉(b)、银粉(c)和金粉(d)对潜指印纹线的选择性较低,用其抖显形成的指印图像较模糊。其中,磁性粉的显现效果优于银粉,银粉优于金粉,这是因为不同显现材料的颗粒尺寸、形态不同,而颗粒的尺寸和形态则使得该材料对指印纹线的选择性不同。

图8 不同材料和方法指纹成像图

通过“刷显”形成的指印图像中,显现效果银粉＞Fe3O4@TMB＞磁性粉＞金粉。而相较于抖显,“刷显”的效果磁性粉、银粉、金粉提升了,Fe3O4@TMB反而有所下降,说明传统显现材料更适合于“刷显”,Fe3O4@TMB更适合于“抖显”。由于Fe3O4@TMB显现指印纹线后还需进行下一步变色环节,故纹线上粉末越多则越有利于后续的变色反应。将a1和a'1对比可知,Fe3O4@TMB通过抖显形成的指印相较于刷显,指印纹线上的粉末更多,更有利于后续的变色反应。

2.6 潜指印中葡萄糖的识别

图9是对潜指印中葡萄糖检测的实验结果。由于葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应的最适pH在7左右,而TMB与H2O2反应的最适pH在3~4之间,这使得对潜指印(固体表面)中葡萄糖的识别需要两次改变pH,较难控制,目前只能以“抖显+滴显”的方式进行葡萄糖的可视化识别,无法实现原位可视化识别,但并不影响其的定性分析。

为增加定性效果,图9(a)中左侧指印下部粘附有额外葡萄糖粉末、上部未添加。通过“抖显+滴显”后,指印中产生如下偶联反应,

反应结果如图9(a)中右侧指印所示。其中,指印上半部分未发生肉眼可见的变色,下半部分产生明显蓝绿色。尽管“抖显+滴显”不能实现指印中葡萄糖的原位识别,但部分指印细节可以被拍照固定。由于手指下部额外附着有葡萄糖,经“抖显+滴显”后,潜指纹上存在明显的蓝绿色,如图9(c)所示。由于图9(b)中的指印没有额外的葡萄糖,潜指纹上半部分未出现明显蓝绿色,但其局部放大图中存在少量蓝绿色像素,这可归因于捺印指印时附着的汗液中存在极少量的葡萄糖。

图9 潜指印中葡萄糖识别图

3 总结与展望

本研究将纳米Fe3O4的双重特性(超顺磁性和辣根过氧化物酶样活性)协同用于潜指印成像,实现了对其二维形态及其中物质信息的同步可视化识别。“抖显+喷显”的方法适用于对多种客体上潜指印的成像,但由于纳米Fe3O4对H2O2的亲和力较低,检测限还有待进一步提升。进一步设计HSV、RGB和灰度相关的程序,辅助实现了对潜指印中H2O2的定性与半定量分析。相较于肉眼观察,HSV定性识别更为灵敏、客观;用灰度进行半定量更准确,不过目前还无法满足犯罪现场复杂背景下的定量分析。与传统显现方法和材料相比,Fe3O4@TMB对指印纹线的选择性更高,对潜指印显现的效果更好;潜指印中葡萄糖的识别需要两次改变pH,较难控制,目前仅初步实现了定性分析,对其原位识别和定量分析还有待进一步完善。

综上,合理利用显现材料的多功能性可挖掘出更多的信息,将显现方法与计算机技术结合,可更好地将指印信息进行数据化与量化。在下一步的工作中,本团队将进一步提升纳米材料的性能、开发更为普适性的定量方法,拟实现对潜指印中更多的内源性物质和外源性物质的原位识别,从其中挖掘出更多有价值的信息。