50份哈萨克斯坦小麦高分子量谷蛋白亚基解析

吴勇昊，刘玉秀，王一钊，桑 珠，朱酉正捷，张正茂

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

小麦作为中国重要的粮食作物，对保障粮食安全发挥着重要的作用[1]。目前，我国小麦产需平衡有余，但随着居民膳食结构升级，对优质小麦的需求量不断增大，致使专用优质小麦供给不足[2]。我国小麦品质面临的主要问题是面筋强度和延展性较差，蛋白质和面筋质量有待进一步提高[3]，因此，进口小麦逐渐成为中国粮食消费的重要补充。哈萨克斯坦是优质小麦的生产国家之一，并稳固全球第六大小麦出口国。哈萨克斯坦小麦籽粒蛋白质相对较高，近一半的小麦籽粒蛋白质含量在14%以上[4]；胚乳的蛋白含量占全麦蛋白的65%，比国产小麦高20%[5]。

小麦品质主要包括加工品质和营养品质[6]。谷蛋白是影响小麦加工品质的重要因素，根据其分子量大小分为高分子量谷蛋白(HMW-GS，high molecular weight glutenin subunits)和低分子量谷蛋白(LMW-GS，low molecular weight glutenin subunits)[7]。研究表明，小麦的HWM-GS是形成谷蛋白聚合体的主要成分，与其面筋特性、烘焙品质等密切相关[8-11]。

HMW-GS由位于小麦1A、1B、1D染色体长臂上的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点上的编码基因控制，统称为Glu-1位点[12]。Glu-B1和Glu-D1位点各包含x、y两种亚基类型，如Glu-B1位点的Bx7、By8、By9、Bx14等，Glu-D1位点的Dx5、Dy10、Dy12等。2种亚基类型通常成对出现，如Bx7+By8(7+8)、Bx6+By8(6+8)、Dx4+Dy12(4+12)及Dx3+Dy12(3+12)，单个类型出现的情况较少；Glu-A1位点只含x类型，常见的亚基类型为Ax1(Glu-A1a)、 Ax2*(Glu-A1b)和 Null(Glu-A1c)[13-14]。HMW-GS的组成和数量明显影响小麦面筋特性、烘焙品质[15-16]，不同的亚基和亚基组合类型对小麦品质的贡献也不尽相同[17]。Ax1(1)、Ax2*(2*)、Bx7+By8(7+8)、Bx13+By16(13+16)、Bx14+By15(14+15)和Bx17+By18(17+18)亚基对烘烤品质有正向效应，携带Dx5+Dy10(5+10)亚基的小麦品种具有较好的面包品质，这些亚基都是公认的小麦优质的高分子量麦谷蛋白亚基；而携带Null和Dx2+Dy12(2+12)亚基则与较差的烘烤品质相关[13,18-21]。在Glu-B1位点，Bx7在小麦中广泛分布，通常会与By8或By9亚基连锁，但Bx7+By8(7+8)亚基组合对小麦面筋的贡献远大于亚基组合Bx7+By9(7+9)[22]。

Payne等[8]利用SDS-PAGE分析小麦的HWM-GS组成，并建立了HWM-GS的Glu-1评分体系，被国内外学者广泛采用[23]。Bustos等[24]和Ovideo等[25]设计了系列区分Glu-D1位点上的2、5、10、12等亚基的特异性引物；张晓科等[26]和Ma等[27]分别建立Glu-A1位点上2*亚基、Glu-B1位点上17亚基的多重PCR反应体系。小麦品种的HWM-GS组成取决于遗传因素，我国小麦品种HWM-GS类型丰富，但Dx5+Dy10(5+10)等优质亚基频率较低[28]，且含有多个优质亚基组合的品种也较少，这是导致我国小麦品质差的重要原因。引进国外优质HMW-GS的种质资源可为我国小麦的品质育种及优质亚基的聚合提供材料，是改善我国小麦品质的重要途径之一，对提高我国小麦加工品质有着极其重要的作用[29]。

本试验利用SDS-PAGE技术、STS分子标记检测和近红外谷物分析仪，对引进的50份哈萨克斯坦小麦种质进行HMW-GS组成及品质性状的分析，旨在了解哈萨克斯坦小麦种质HWM-GS的组成，以期筛选出含有优质亚基及优质亚基组合的小麦材料，为我国小麦品质的改良提供重要参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以引进的50份哈萨克斯坦小麦种质为供试材料，西农979(1/7+8/2+12)、中国春(Null/7+8/2+12)为HWM-GS亚基对照材料，均由西北农林科技大学旱地小麦育种课题组提供。

试验材料于2019-2020年度在西北农林科技大学曹新庄试验农场种植，采用随机区组设计，每个品种(系)种植3行，行长1.5 m，行距0.25 m，重复三次。田间管理同当地大田生产，收获后，种子经过精选、晾晒后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 HMW-GS提取及评分

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对HMW-GS的组成进行分析，按照郑青焕等[30]方法提取HMW-GS，参照Payne等[8]方法，建立Glu-1位点亚基的质量评分系统，具体见表1。

1.2.2 PCR分子标记

取幼苗0.3 g左右，采取改良CTAB方法提取小麦的基因组DNA[31]。特异性分子标记的引物序列、反应体系和程序同文献，具体见表2。PCR扩增产物用1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为1×TAE溶液，160 V电压电泳 45 min，染色、扫描成像。

1.2.3 品质性状分析

利用DA7200近红外谷物分析仪测定供试小麦籽粒的粗蛋白含量、湿面筋含量、吸水率、淀粉含量、沉降值、容重。

表1 HMW-GS的评分Table 1 Quality scores assigned to individual or pairs of HMW glutenin subunits

表2 试验用分子标记Table 2 Primers of molecular markers used in the study

1.3 数据分析

采用Excel 2010进行数据处理，采用SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 哈萨克斯坦小麦种质HMW-GS的组成分析

由表3和图1可知，在50份供试小麦种质资源中，共检测出8种不同类型的HWM-GS。其中，Glu-A1位点有1和N共2种类型，N亚基出现频率较高，为66%，1亚基出现频率为34%；Glu-B1位点有7+8和7+9共2种类型，7+9亚基出现频率较高，为78%，7+8亚基出现频率为22%；Glu-D1位点有5+10、2+10、2+12及4+12共4种类型，5+10亚基出现频率最高，为56%，2+12亚基出现频率为38%，2+10和4+12出现频率较低，分别为4%和2%。利用HWM-GS特异性分子标记对供试小麦各个亚基进行验证，在Glu-A1位点，含亚基Null的品种中可扩增出920 bp的条带(图2)；在Glu-B1位点上，则含亚基9的品种中可扩增出707 bp的条带(图3)；Glu-D1位点，含亚基5的品种中可扩增出478 bp的条带(图4)；在Glu-B1位点，含亚基8的品种中可扩增出527 bp的条带(图5)；没有检测到2*、7OE相应的条带。此结果与SDS-PAGE结果一致，说明两种检测方法均准确可靠。

表3 50份哈萨克斯坦小麦种质 Glu-A1、 Glu-B1、 Glu-D1位点的HMW-GS及其频率Table 3 HMW-GS and their frequency on Glu-A1, Glu-B1,and Glu-D1 loci of the 50 Kazakhstan wheat germplasm

2.2 50份哈萨克斯坦小麦亚基组合及其评分

由表4可知，供试小麦的品质评分大都在7、8分，平均得分为7.10。在Payne 评分体系中(表1)，1A、1B、1D最高得分分别是3、3、4分。在50份供试小麦中，组合为1/7+8/5+10的得分达到10分，占比8%；评分≥7的材料有34份，占供试材料的68%；评分最低的亚基组合为1/7+9/4+12(3分)，频率是2%。评分为7的哈萨克斯坦小麦种质材料最多，共有17份，其亚基组合有N/7+9/5+10和1/7+9/2+12，频率为34%。

由表4可知，在供试小麦中，共检测出9种HMW-GS组合类型，其中组合N/7+9/5+10，出现频率最高，达到30%，其次是组合N/7+9/2+12，出现频率为28%；组合1/7+9/5+10、1/7+8/5+10、N/7+8/5+10、1/7+9/2+12、1/7+8/2+12、1/7+9/4+12、N/7+9/2+12、1/7+8/2+10出现频率分别是12%、8%、8%、6%、4%、2%、2%、2%。

SP和979:中国春和西农979; 22～33:试验材料

M:D2000;1～8:试验材料

M:D2000;1～9：试验材料

表4 50份哈萨克斯坦小麦种质的HMW-GS 组合及其评分Table 4 HMW-GS combinations and quality score of the 50 wheat germplasm from Kazakhstan

2.3 50份哈萨克斯坦小麦品质性状分析

由表5可知，在品质性状中，沉降值的变化范围最大，为11.2～34.7 mL，变异系数为21.8%；其他指标变异系数较低，依次为湿面筋含量、粗蛋白含量、淀粉含量、含水量、吸水率和容重。总体来看，沉降值和湿面筋含量的变异系数较高，遗传多样性丰富，具有遗传改良潜质。小麦的烘焙品质主要与湿面筋含量、粗蛋白含量以及沉降值呈正向相关[11-12]。对供试小麦进行品质比较发现，编号为9、18、36号的烘焙品质较好。

M:D2000;16～24:试验材料

M:D2000;9～19:试验材料

表5 50份哈萨克斯坦小麦品质性状分析Table 5 Quality trait analysis of the 50 wheat germplasm in Kazakhstan

2.4 50份哈萨克斯坦小麦HMW-GS亚基分布对小麦品质影响

由表6可知，在Glu-A1位点上，携带1亚基的小麦材料的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值和吸水率显著高于携带Null亚基的材料。在Glu-B1位点上，携带7+8亚基的小麦材料的蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值和吸水率显著高于携带7+9亚基的材料。在Glu-D1位点上，四种亚基对小麦不同品质指标的影响不同，其中，携带2+12和5+10亚基的材料的吸水率明显高于含有其他亚基的材料，而携带5+10亚基的材料的沉降值显著高于含有2+12亚基的材料；对蛋白质含量和湿面筋含量，含有2+12和5+10亚基的材料间无显著性差异；携带4+12亚基材料的沉降值显著高于携带其他亚基的材料，但其蛋白质和湿面筋含量低于携带其他亚基的小麦材料。

表6 不同HMW-GS亚基对小麦品质的影响Table 6 Effect of different HMW-GS subunits on wheat quality

3 讨 论

准确有效地鉴定HMW-GS对加快小麦品质改良具有重要意义[32]。目前，分离鉴定HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE、RP-HPLC及分子标记等[33-36]。SDS-PAGE 是分离和鉴定HWM-GS的传统方法，但这种方法不能有效鉴定Bx7OE和By8*亚基及Ax2和Ax2*等分子量接近的亚基[36-37]，且费时费力。随着越来越多的HWM-GS基因被克隆，相应的分子标记也不断地发展[38]，本研究先利用SDS-PAGE对50份哈萨克斯坦小麦种质HWM-GS进行鉴定，并利用PCR分子标记进行了验证，发现两种方法鉴定结果一致，说明这两种方法均可用于小麦育种中优质亚基检测。

对国外引进材料进行HMW-GS组成分析，可以为我国小麦品质育种提供重要种质资源。在Glu-A1位点上，1和2*亚基是强筋小麦的优质亚基，陈 杰等[20]在94个黄淮麦区新育成的小麦品种Glu-A1位点，检测到1和N亚基，未检测到2*优质亚基。这与本研究结果一致，推测Glu-A1位点上优质亚基的匮乏是制约小麦品质提升的重要因素。在Glu-B1位点，我国小麦主要携带7+9和7+8亚基，张自阳等[19]分析了148份小麦种质Glu-B1位点亚基类型，发现7+9和7+8亚基占比81.8%；范家霖等[17]对黄淮海麦区近20年来生产种植的小麦品种(系)Glu-B1位点亚基类型分析，发现7+9和7+8亚基出现频率较高，为77.2%，本研究在Glu-B1位点检测的7+9和7+8亚基较少，可能与检测样品数量较少或者哈萨克斯坦小麦种质特性有关。张学勇等[39]分析了我国5 129份小麦初选核心种质，发现HWM-GS亚基组成较为单一，主要由Null、7+8、2+12组成，频率分别是92.92%、81.65%、 85.68%，而与面包烘烤品质显著相关的5+10亚基出现频率较低。5+10亚基是公认的对强筋品质有正向效应的优质亚基，Horvat等[40]发现，含有1和5+10亚基的小麦具有良好的面包品质，其中Glu-D1位点上的亚基对面包的品质的影响最为显著。本试验中，共有28份小麦含有5+10亚基，频率为56%；在强筋品种选育过程中，应加强该类资源的有效利用。

张金乾等[44]对陇东地区小麦资源的 HMW-GS组成和品质分析，发现携带2*/7+9、5+12亚基组合的小麦综合品质性状较优。HMW-GS对小麦蛋白质含量影响较小，但是对馒头加工品质和面团筋力有着显著影响[45]。其中，携带1/7 + 9/5+10、1/7 +8/2+12亚基组合的小麦种质馒头的加工品质较好[46]。本研究中，含有1/7 + 9/5+10、1/7+8/2 +12亚基组合的小麦种质共有8份，占比16%，可用作馒头加工的原材料。

本研究的50份哈萨克斯坦小麦的品质评分均值为7.10，其中评分为10分的材料有4份，评分≥8的材料有17份，基本达到了中强筋小麦水平[41]。张玲丽等[42]分析国内186份普通小麦种质材料的平均得分为6.90；郑青焕等[30]对21份印度小麦材料进行了分析，其平均得分为7.52；Fu等[43]对64份澳大利亚的小麦种质进行小麦品质评价，平均评分为7.40分。外引种质资源评分普遍高于国内小麦品种，其中优质材料可为我国小麦品质改良提供优良的基因来源。