三雌蕊小麦EMS诱变株系的农艺性状评价及SSR多态性分析

李玉豪，余周源，佟·乌日娜，廖明莉，国钰环，魏淑红，杨在君，彭正松

(1.西华师范大学生命科学学院，四川南充 637009； 2.西华师范大学环境科学与工程学院，四川南充 637009； 3.西昌学院农业科学学院，四川西昌 615013)

小麦是全球最重要的粮食作物之一[1-2]。据联合国粮食及农业组织(FAO)统计，2020年全世界小麦种植面积约2.33亿hm2，总产量7.77亿t(http://www.amis-outlook.org/#jfmulticontent_c363419-2)。然而由于人口的激增，预计到2060年，小麦产量需增加70%方能满足人类的消费需求[3]。因此，高产育种仍然是小麦育种的主要目标。在长期的进化演变过程中，由于人工选择和自然进化，导致小麦的遗传多样性日趋狭窄，遗传脆弱性逐渐增加[4]。创制新的小麦突变体不仅有利于拓宽小麦育种材料的遗传基础，而且为小麦基因功能研究提供材料。

在自然条件下，生物突变的概率很低，而人工诱导的突变率相对较高。人工诱导突变可分为物理诱变、化学诱变、生物诱变等。物理诱变是通过紫外线、射线、离子束等方法使基因发生突变，其突变具有染色体畸变频率高、结构变异广、染色体组紊乱、后代不育率高、分离类型广、纯合世代长等特点[4]。生物诱变是通过T-DNA和转座子插入实现基因突变[5]。但小麦是异源六倍体植物，基因组较大，T-DNA插入后突变体的鉴定工作量大，因此获得优良的突变资源相对困难[6]。而化学诱变剂则能够使植物体产生可遗传变异，其中甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)的应用最为广泛，且诱导效果较好。利用EMS构建突变体库有不需要遗传转化、容易诱发形成点突变、不易造成染色体畸变等优点[7]。

EMS诱变在小麦遗传育种中已得到了广泛的应用，为小麦品质育种提供了优质的种质资源。赵天祥等[8]利用EMS诱导六倍体小麦偃展4110种子，获得了在自然变异中少见的的特矮变异类型(株高仅10～15 cm)。孙玉龙等[9]通过EMS诱导小麦盛农1号，从4 500个M2代中筛选出174个突变体株系，经过M3代验证及生物学性状和农艺性状调查，获得了18个可稳定遗传的株系。于利伟等[10]以小麦西昌69的EMS诱变系M6代为试验材料，进行HMW-GS分析，获得了101份HMW-GS变异诱变系，其中28份诱变系的多个籽粒品质性状及不溶性蛋白聚合体含量优于亲本，且千粒重相对稳定。

利用EMS诱变六倍体小麦构建突变体库已有不少研究报道，但小麦的基因组非常庞大，构建的突变体库还没有达到饱和[11]，尤其是利用EMS诱导雄蕊和雌蕊突变体尚未见研究报道。“三粒小麦”最早由陈济世等[12]发现，但其亲本不能确定。Peng等[13]对三粒小麦进行了多年选育，培育出能稳定遗传、遗传背景清楚(三雌蕊性状由一对显性核基因控制)的三雌蕊小麦(TP)种子。TP具有正常的雄蕊和三个可育的雌蕊，可结3粒种子，具有穗粒数多、稃片开张、角度大等特点[14]。本研究通过对TP进行EMS诱变处理，获得能够稳定遗传的雌、雄蕊突变体，并对其进行SSR分析和农艺性状分析，以期获得与TP具有显著差异的突变体，为小麦三雌蕊性状基因的克隆和基因功能验证奠定基础，同时也为小麦花发育研究和杂交育种提供材料。

1 材料与方法

1.1 TP种子的EMS诱变处理

挑选饱满的TP种子6 300粒，100粒为一组。利用pH =7.0的磷酸缓冲液配制浓度分别为0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%的EMS溶液，在室温下(25 ℃左右)对TP种子进行浸泡处理，每个浓度分别处理3、5和8 h，设置3个重复[11,15]。TP种子经EMS溶液处理后，用无菌水冲洗15 min。将滤纸平铺于培养皿中，用清水浸润，将每份种子平铺于培养皿中，并在培养皿上标记处理时间及浓度。将培养皿置于25 ℃培养箱中暗培养催芽，统计发芽率；利用半致死EMS浓度及处理时间处理5 000粒饱满的TP种子。将EMS处理后的种子以及对照种子(未经EMS处理)种植于西华师范大学生命科学学院试验田中，行长1 m，行距20 cm，株距10 cm，常规田间水肥管理。M1代植株严格套袋自交，成熟后每株取1粒种子，形成M2代单粒传群体。M2代种植条件同上，套袋自交后每株取1粒种子，形成M3代单粒传群体。

1.2 农艺性状测定

于小麦灌浆期前后，测定M3代突变株系的农艺性状，各株系随机选择10个单株进行测定，取平均值进行分析。测定的农艺性状包括株高、穗长、穗下节间长、旗叶长、旗叶宽、倒二叶长、倒二叶宽、小穗数和穗粒数。

1.3 SSR分析

使用GENEOUTTM植物DNA提取试剂盒(LABGENE，中国)提取M3代突变体植株和对照TP叶片的DNA。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用NANODROP 2000c微型紫外-可见分光光度计(Thermo，美国)检测DNA的浓度和纯度。

普通小麦含有A、B、D三个染色体组，每个染色体组有7条染色体，为了检查诱变植株的多态性，分别在每条染色体上随机挑选5个微卫星标记(SSR)设计引物，引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。SSR的PCR扩增体系为10 μL，包括模板DNA 1 μL，正、反向引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL，2×PCR Taq Master Mix 5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，50～61 ℃(根据不同的引物设置不同的退火温度)退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环。在正式试验前，用TP的叶片DNA对105个SSR标记进行了筛选，筛选出22个条带清晰、重复性好的标记对突变体进行检测(表1)。

表1 SSR引物名称及序列Table 1 Name and sequence of SSR markers

用毛细管电泳系统(capillary electrophoresis，CE)对PCR扩增产物进行检测。PCR扩增出的条带按有或无记录，有扩增带时记为1，无扩增带记作0，将所有引物扩增条带的结果统计为0和1的矩阵[16]。不同材料之间的遗传相似系数(GS)按Nei等[17]的方法进行计算，公式为GS=2Nij/(Ni+Nj)。其中Ni和Nj为2份材料独有的条带数，Nij为2份材料共有的条带数。利用NTSYSpc 2.10e聚类分析软件来计算各个突变体之间的遗传相似系数，在获得矩阵数据之后再对20个突变株系和对照TP通过非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 EMS对TP种子发芽率的影响

从表2可以看出，未经EMS处理的TP种子，在不同处理时间其发芽率均大于90%。随着EMS浓度的升高以及处理时间的延长，种子发芽率逐渐降低。当EMS浓度为1.2%或1.5%、处理时间为8 h时，种子全部死亡。EMS的半致死浓度和处理时间为0.8%的EMS处理8 h。后续TP种子的诱变处理则选用该半致死条件进行。

表2 不同EMS浓度及处理时间对TP种子发芽率的影响Table 2 Effect of different EMS concentrations and treatment time on germination rate of TP seeds %

2.2 突变体类型及突变频率调查结果

经EMS浸泡的5 000粒种子共长出2 740个M1植株，在其M2单传群体中共发现39个突变植株，突变率为1.42%。其中，三雌蕊性状回复成单雌蕊性状(single pistil，SP)的有22个植株，占所有突变植株的56.4%；雄蕊同源突变成雌蕊(pistillody，PI)的有6个植株，占所有突变植株的15.3%。其他突变类型包括发育不良(1株)、分蘖减少(1株)、矮化(2株)、发育迟缓(2株)、穗长变长(1株)、穗形尖锐(1株)、麦芒变长(1株)、穗壳蟹爪状对钩(1株)和叶片卷曲(1株)。

本研究主要分析22个SP株系和6个PI株系。由于部分突变植株自交结实率低，在M3代中能稳定遗传的SP株系和PI株系分别有15(SP1～SP15)和5个(PI1～PI5)。后续均基于这20个株系进行分析。SP株系表现为一个雌蕊，三个雄蕊，如图1中的SP7。PI株系表现为雄蕊数量减少，雌蕊数量增加，如PI2有四个雌蕊，无雄蕊；PI5有五个雌蕊，一个雄蕊(图1)。

TP：三雌蕊小麦；PI1～PI5：雄蕊同源转化为雌蕊突变体；SP7：单雌蕊突变体。

2.3 M3代突变株系的农艺性状

对M3代中的15个SP株系和5个PI株系以及对照TP的主要农艺性状进行调查和分析，结果如表3所示。所有SP株系和PI株系的穗粒数均极显著降低。大部分SP株系的株高未出现明显变化，只有SP4、SP11和SP13株系的株高显著升高；SP7株系的株高显著下降，出现了明显的植株矮化现象，与TP相比，株高平均降低 38.27%；PI株系中，PI1株系的株高显著降低，PI4株系的株高显著提高。此外，与TP相比，SP4、SP6和PI4株系的穗下节间长显著或极显著伸长，SP7、SP8、SP12、SP14、SP15、PI1、PI2和PI5株系的穗下节间长显著或极显著变短；大部分SP株系和PI株系的旗叶长和旗叶宽均显著或极显著降低(除SP5和PI5株系的旗叶宽与TP差异不显著)；SP2和SP7株系的倒二叶长显著增加，SP3、SP4、SP10、SP12、SP13、PI1、PI2和PI4株系的倒二叶长显著降低；除SP2、SP5、SP6和PI2株系外，其他株系的倒二叶宽均显著降低(表3)。

表3 M3代突变体株系的农艺性状表现Table 3 Agronomic traits of M3 mutant lines

2.4 M3代突变株系的SSR标记分析

2.4.1 M3代突变体DNA的提取结果

各突变体的DNA浓度均在50～200 ng·μL-1之间，且OD260/OD280在1.8～1.9之间。琼脂糖凝胶电泳结果表明，DNA条带单一、清楚、无明显的降解。这说明所提取的DNA质量较高，可用于后续分析。

2.4.2 SSR标记的多态性

部分SSR标记的扩增结果如图2所示。可以看出，22个标记共扩增出61个条带(等位基因位点)，每个标记可扩增出1～7个等位基因，共含有42条多态性条带，多态性率达68.85%。平均每个标记扩增出2.77个等位基因。其中，2B染色体上的标记Xgwm257-2B扩增的条带数最多，为7个。22个标记中有4个标记的扩增条带只有1个，分别是Xgwm136-1A、Xgwm403-1B、 Xgpw3238-4A和Xgwm66-4B。这些数据表明，SSR标记可用于EMS诱变后突变体遗传多样性的检测。

图2 SSR标记Xgwm257-2B的扩增结果

2.4.3 突变株系间的遗传相似性系数

20个突变株系与TP对照之间的遗传相似系数变化范围在0.352 9～0.956 5之间。说明20个小麦突变株系在SSR基因座上具有较高的遗传多样性，这些突变体具有丰富的遗传基础。

使用UPGMA法进行聚类分析，结果(图3)表明，样本可以被SSR标记相互区分。当遗传相似系数为0.61时，21份材料(20个突变株系和TP对照)被分为两大类。其中第Ⅰ大类包含14份材料，除TP和PI1外，大部分SP株系被划分到第一类，同时第一大类又被分为两个亚类，分别为Ⅰ-1和Ⅰ-2，而Ⅰ-2亚类全部为SP株系。第Ⅱ大类包含剩下的7个突变株系，包括3个SP株系(SP2、SP14和SP15)，4个PI株系(PI2～PI5)。虽然这7个突变株系的农艺性状差异较大(表3)，但聚类分析结果表明这7个突变株系在DNA水平上具有一定的相似性。

图3 TP与M3代突变株系UPGMA聚类图

3 讨 论

3.1 EMS诱变对种子发芽率的影响

EMS诱变发生在DNA的非编码区和编码区，主要引发G/C突变成A/T或A/T突变成G/C，引起错义突变、无义突变或更罕见的移码突变，导致基因表达量、mRNA稳定性以及蛋白质结构发生改变[18]。EMS诱变已成功应用于燕麦[19]、大麦[20]、玉米[21]、小麦[22-23]等多种作物，可用于筛选耐盐、抗病、抗倒伏等突变体，亦可从中直接筛选出感兴趣的突变基因。

研究表明，适宜的诱变浓度和诱变时间是提高EMS诱变率的关键[24]，一般以诱变后植株存活50%所需的EMS浓度(半致死剂量)作为诱变敏感性指标[25]。本研究利用不同浓度的EMS溶液(0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、1.2%和 1.5%)和浸泡时间(3、5、和8 h)处理小麦种子，结果表明，浓度为0.8%的EMS溶液处理TP种子8 h时接近半致死剂量。当浓度过高，时间过长时，EMS会对种子产生严重损伤，种子发芽率出现明显下降，当EMS浓度达到1.2%或1.5%，且处理时间为8 h时，种子的发芽率为0。当EMS浓度上升到一定程度时，突变率不会随着浓度增加而增加，反而可能因为植株大量死亡出现突变率下降的情况。

3.2 EMS诱变类型与频率

本研究从2 740个诱变植株中，共发现39个表型发生明显变异的突变体，突变频率为 1.42%。低于前人研究的突变频率(9.17%[26]、 6.6%[8]和3.87%[9])，原因可能是除了品种和遗传背景差异外，本研究用EMS诱导的小麦很大一部分突变是非表型突变或大部分植株为杂合体，而导致突变性状未被统计。因此，想要获得更多的突变体，应该在M3及以上世代中进行筛选。有些突变体性状(例如植株高度、成熟快慢等)除受遗传因素影响外，很大程度上也受环境以及出现雄性不育情况的影响，这也是本研究在M2代中发现有28个雌蕊和雄蕊突变植株，但在M3代中能稳定遗传的只有20个株系的原因。

3.3 SSR标记分析

由于SSR标记在小麦中的多态性高且具有染色体特异性[27-28]，能够克服RFLP、RAPD等标记的不足，所以在小麦中的应用越来越广泛[29]。本研究从105个标记中挑选出了22个条带清晰、重复性好的标记，对包括TP在内的21份材料(20个M3变异株和TP对照)进行SSR分析和聚类分析。聚类结果表明，不同突变性状之间可以较好地被区分开，相同突变性状可以被较好地聚在同一簇下，说明即使只使用相对较少的SSR标记，也可以检测小麦种质资源间的遗传多样性，这和Plaschke等[30]的研究结果一致。

研究表明，从20世纪90年代开始，中国小麦的多样性指数和遗传距离有所下降，原因可能是缺少新的突破性育种亲本，以及大量使用一些相同骨干亲本所导致[29,31]。本研究SSR分析结果表明，诱变植株的遗传距离及遗传多样性相对丰富，在缺少育种亲本的情况下，诱变育种是一个较好的增加遗传多样性的方法。

3.4 M3代突变株系的农艺性状分析

本研究通过EMS诱变TP构建了EMS突变体库。从M3代中获得了20个农艺性状发生明显变异的SP和PI株系。从突变体的雌雄蕊表型可以看出，这些突变体与对照TP具有明显差异，这对研究小麦花发育奠定了基础。其中，SP和PI株系均发生了花器官改变，SP株系是由三雌蕊回复突变为单雌蕊，PI株系是由雄蕊同源突变为雌蕊，两种突变类型的产量均明显低于TP，尤其在PI株系中，出现了不育现象，但是创制出了与TP的三雌蕊性状具有显著差异的对照材料，为后续小麦雄蕊和雌蕊发育机制研究提供了理想的试验材料。虽然大部分诱导植株的突变方向不好，但在本试验中，出现了个别相对优良的性状，如SP7株系的平均株高比对照TP下降了38.27%，平均株高仅为67.10 cm。前人发现控制小麦株高的基因有20余个，其中只有5个是自然突变，其余均为诱导突变[8]，SP7植株矮化可能与上述某个基因有关，也可能与新的突变基因有关，但还需要进一步深入研究。