液相色谱-串联质谱技术与分子网络的成分检测方法在植物性饲料添加剂领域的应用进展

王瑶瑶 高品一 李丹琦 刘学贵

(1.沈阳化工大学制药与生物工程学院，沈阳 110142；2.沈阳化工大学功能分子研究所，沈阳 110142；3.辽宁省绿色功能分子设计与开发重点实验室，沈阳 110142；4.硼镁资源开发与精细化工技术国家地方联合工程实验室，沈阳 110142)

饲用抗生素对我国畜牧业的发展做出了巨大的贡献，其应用已有60多年的历史。但抗生素的滥用导致了细菌产生耐药性、药物残留和食品安全等一系列问题的出现。目前，国家已出台相应政策禁止抗生素在饲料添加剂领域的使用[1]。随着抗生素逐步退出饲料添加剂市场，绿色的新型饲料添加剂已成为主流趋势，植物提取物[2]、酶制剂[3]、酸化剂[4]等逐渐成为抗生素替代品研究的热点。

植物提取物是一类来源于植物、具有1种或多种生物学功能的活性物质，其活性成分基本可以分为黄酮类化合物、生物碱类化合物、单宁类化合物、挥发油类化合物和多糖类化合物等[5]。因其具有抗炎、抗菌、抗氧化、调节血脂、促进动物的生长发育以及调节肠胃和免疫功能等优势，在世界范围内已引起了广泛的关注[6-10]。王勇等[11]研究发现，在基础饲粮中添加1%苜蓿皂苷提取物，可提高肉牛生长性能、瘤胃消化功能及发酵性能。Ding等[2]研究发现，饲喂杜仲提取物可提高断奶仔猪的生长性能和抗氧化能力，改善肠道功能，且效果优于饲用抗生素。同时大量研究表明，杜仲提取物在提高鸡、羊、鱼等动物的生长、抗氧化性能等方面也具有显著优势[12-15]。目前植物提取物在饲料添加剂领域已经取得了一定的成果，但对其用法用量和检测方法尚未作出明确规定[16]。因此，对其活性成分进行定性定量分析对于规范饲料添加剂质量标准具有重要意义。

天然植物成分组成极为复杂，且植物的产地、采集时间等都会影响植物提取物的有效成分含量，从而影响功效。为了确保饲料添加剂的安全性和稳定性，需确立植物提取物中活性成分的检测方法，而这一直是饲料添加剂质量标准的技术问题。目前，生物医药领域多采用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱、气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术或液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术，并结合主成分分析(PCA)法建立的模型对植物中活性成分进行综合评价以及聚类分析[17-19]。LC-MS/MS因其效率高、精密度高等优势已成为植物中成分的主流鉴定技术，但传统的后期质谱数据处理过程耗时费力且可视化程度较差[20-21]。分子网络(MN)是近年来发展起来的一种可视化计算策略，其原理与PCA法相比，具有操作简便、高效快捷、可视化程度高、数据兼容性强等特点[21]。本文基于LC-MS/MS技术结合MN对植物提取物成分定性及定量分析进行相关研究的综述，为植物性饲料添加剂的成分鉴定及质量控制提供思路和参考。

1 MN的建立和可视化分析

1.1 MN的建立

MN是一种串联质谱(MS/MS)的数据处理方法，最初是Watrous等[22]将其应用到微生物领域，随后应用在海洋生物[23]、真菌[24]、天然植物[25]等天然产物领域，近年来已广泛应用于代谢组学和药物研发等方面[26]。其主要原理是：结构类似的化合物在相同的质谱分离条件下，会产生相似的二级质谱碎片离子。计算机对这些碎片离子进行相似度计算，根据相似度得分将二级质谱数据分为不同的簇，并整合成1张可视化的MN图。在这个可视化的图谱中，每1个节点代表1个化合物的二级质谱图，节点的不同颜色则代表了化合物的不同来源；节点间有连线代表2个二级质谱图之间有相关性，根据连线的粗细可以判断其相关性的大小[27-28]。基于MS/MS的MN可在不知道样品成分组成的前提下，对来自样品的大量质谱数据进行聚类和可视化分析，并且该技术对于各种质谱仪器(如Waters、Agilent等)采集的数据都是兼容的。

1.2 全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台的介绍及可视化分析

GNPS数据库是一个开源的质谱数据共享的知识平台，为全球的科研工作者提供了大量共享的以及鉴定的MS/MS数据，推动了对于未知化合物探索的工作进程。为了方便使用MN，GNPS自2014年正式开放使用，该平台每月的访问量可达到30万次[29]。GNPS数据库已经收录了22 644个化合物和235 850个谱图，这些化合物和谱图主要来自于第三方数据库(MassBank、HMDB、ReSpect、NIST等)以及全球多个科研机构采集的质谱图资料[30-31]。除鉴定已知化合物、类似物和MN自动分析的功能外，GNPS数据库还可以对不同来源的二级质谱数据进行存储及更新，而且GNPS通过借助加利福尼亚圣地哥分校(UCSD)计算质谱中心(CCMS)的计算基础设施，提供了分析数据集并将其与所有公开可用数据进行比较的能力[31]。MN的可视化可以通过GNPS平台在线得到，也可将数据导入Cytoscape软件[32]进行可视化分析[26]。可视化MN图构建流程如图1所示。

图1 构建MN的流程图

2 LC-MS/MS结合MN在植物提取物成分检测中的应用

2.1 LC-MS/MS结合MN在植物提取物化学成分定性分析中的应用

植物提取物是一个复杂体系，往往包含多种化合物。MN根据二级质谱碎片离子的相似度大小将植物提取物中的化合物分成不同的簇并整合成1张可视化网络图谱，通过分析已知化合物的质谱图可以对其他未知物进行快速解析，对于植物提取物的成分鉴定具有重要意义。如图2所示，MN的建立一般分为如下几个部分：1)制备植物提取物；2)将待测样品溶液进行质谱进样分析，采集数据；3)将原始的二级质谱数据用ProteoWizard软件进行格式转化，转化为.mzXML格式；4)将数据上传至GNPS分析平台进行MN分析，采用Cytoscape软件构建网络可视化；5)通过GNPS在线分析MN，MN图中可直观显示提取物中的化合物与标准品的结构相似度，比较相关节点之间质谱数据的异同，从而可以得出与已知化合物结构相似的化合物或者其他未知化合物[33]。

图2 MN定性分析流程图

De Oliveira等[34]采用LC MS/MS技术结合MN对Adenocalymmaimperatoris-maximilianii(Wawra) L. G. Lohmann提取物进行成分鉴别，共鉴定出63个化合物，多为黄酮苷类化合物，还首次从该植物中指认出了含有异戊二烯基的黄酮类化合物。Cheng等[35]采用柱后衍生化的高效液相色谱-紫外-荧光(HPLC-UV-FLD)联用技术，对具有抗氧化活性的山茶乙酸乙酯萃取物的具体活性成分进行筛选，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术(UPLC-QTOF-MS/MS)和MN方法从萃取物中分离得到一种新型抗氧化剂冲山茶苷(okicamelliaside)。Yang等[36]通过高分辨LC-MS/MS结合MN辅助分析，从废弃肉桂叶水提物中鉴定得到101个化合物，其中酚酸、萜及其苷类为主要成分，并在肉桂叶中首次发现了内酯、木脂素和黄烷醇类化合物，利用2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)法和铁离子还原/抗氧化能力(FRAP)法结合MN分析发现了1个抗氧化成分。目前UPLC-QTOF-MS/MS结合MN技术已应用于牡丹果实提取物[37]、银杏叶提取物[38]、番石榴叶提取物[39]、问荆提取物[40]、红毛丹种子提取物[25]等植物提取物的化学成分分析。此外，采用MN可以对不同批次样品中的化学成分进行可视化分析，直观显示不同来源样品中化学成分的差异，有研究使用MN技术比较了2种亲缘关系较近的大戟属植物Pithyusa和Cupanii中的二萜类化合物，并发现了抗基孔肯雅病毒(chikungunya virus)复制的新化合物[41]。

LC-MS/MS技术结合MN在植物提取物化学成分鉴别方面发挥着独特的作用，可高效、准确地对植物中活性成分进行定性分析，利于阐明其活性成分与功效之间的关系，并可结合网络药理学等工具从分子水平研究其作用靶点，为其药效物质基础的研究奠定基础。

2.2 LC-MS/MS结合MN在植物中活性成分定量分析中的应用

由于天然植物的品种、产地、采集时间、炮制加工方式等不同会影响饲用植物添加剂的功效，远不能满足商品化饲料添加剂的要求，给其质量控制的研究带来巨大困难。一般情况下，LC-MS/MS可以实现对不同来源植物提取物中的化学成分快速鉴别，但对其进行定量分析始终是一个难题。对此，Winnikoff等[42]提出了MN定量的新策略，即基于串联质谱原点跟踪引擎(TOrTE)的MN定量分析方法，可对提取物中的特定化学成分进行相对或绝对定量。MN的定量分析步骤如图3所示：1)采集植物提取物的质谱数据；2)将每个节点的原始质谱数据通过TOrTE转化为“cluster_info.txt”文件；3)进行格式转化，将质谱数据文件转化为“.mzXML”格式；4)使用ProteoWizard软件提取每个节点的色谱峰，计算其对应面积之后保存在注释表中；5)通过Cytoscape将计算得到的各峰面积映射在饼状图中。其中，1个节点代表1种化学成分，节点的颜色代表化学成分的来源，每个节点中各颜色所占面积大小代表某个化学成分在不同来源样品中的相对含量。

图3 MN定量分析流程图

非靶向LC-MS可以对不同来源植物的提取物中的化学成分快速鉴别，同时可以结合MN对目标成分进行定量分析。袁恩等[21]采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱串联质谱联用(UHPLC-LTQ/Orbitrap MS)技术结合GNPS的MN，分别比较了不同炮制、干燥方式对鲜蟾酥中26种蟾毒配基类成分和34种蟾蜍毒类成分的含量差异，考察了炮制溶剂、温度等因素对炮制前后蟾毒配基类成分和蟾蜍毒类成分的影响，并通过MN技术考察了不同类型的二萜类化合物在8种大戟属植物中的分布以及含量差异，明确不同植物中有效成分的含量，该工作可以为降低药材选取工作的盲目性提供帮助。Winnikoff等[42]利用LC-MS/MS技术收集到20种海洋蓝细菌粗提物的质谱数据，通过MN将质谱数据整合到1个可视化图谱中，采用基于TOrTE的MN定量方法对海洋蓝细菌(Okeaniahirsuta)中含量最高的鞘丝藻酰胺C进行了定量研究，结果发现，1 mg海洋蓝细菌至少能产生鞘丝藻酰胺C的量为0.024 mg，占海洋蓝细菌干重的2.4%。基于TOrTE策略的MN定量方法不仅可以直观地分析不同来源提取物中化学成分的差异，而且可以分析不同来源提取物中化学成分的相对或绝对含量。将MN应用于饲料添加剂中有效成分的含量测定，以及不同来源饲用植物提取物的成分差异性检测，对饲用植物提取物的质量控制提供安全稳定的数据支撑。

2.3 LC-MS/MS结合MN在复合植物提取物成分检测中的应用

植物提取物的组合替抗是利用各提取物中不同活性成分及功效的互补特性，将其复配后进行下一步活性研究。复方中草药根据“君臣佐使”的原则进行配伍，主要成分在配伍过程中可能会发生从量到质的变化[43]，为复合型饲料添加剂质量标准的研究带来困难。单一植物提取物中的活性成分并未充分发挥其组合和协同优势，目前科研人员将关注的重点转向了复合植物提取物。刘胜敏等[44]通过在断奶仔猪饲粮中添加200 mg/kg的假蒟和番石榴叶复合提取物，可明显提高断奶仔猪抗氧化性能和免疫功能。Xue等[45]利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS结合MN对中医经典处方二冬汤中的化学成分进行综合分析和表征。在负离子模式下，初步鉴定出113个化合物，主要为甾体皂苷类化合物、三萜皂苷类化合物及黄酮类化合物；此外，在正离子模式下，鉴定出10个生物碱类化合物，利用该方法提高了中药复方中化合物的鉴定效率。

对中药复方成分进行化学成分研究，阐述其配伍规律、作用机制、规范质量控制标准具有重要意义。随着现代分析技术的发展，LC-MS技术在复方的化学成分及其含量的鉴定分析方面得到广泛应用[43]。杜芹芹等[46]建立HPLC-ESI-MS法，研究了不同比例的人参与干姜或赤芍配伍过程中人参皂苷的含量变化。同时，还有学者采用LC-MS/MS技术研究了黄柏与知母不同配比煎煮液中的黄柏碱、巴马汀、小檗碱、药根碱和木兰花碱的含量变化，结果表明，黄柏中配伍知母后，会对巴马汀、小檗碱、木兰花碱和黄柏碱含量产生影响[47]。然而利用LC-MS/MS技术对植物提取物或中药复方进行分析采集到的数据往往多达上千个，由于对照品匮乏以及质谱数据库不够全面等问题，给数据分析工作带来了一定的阻碍。GNPS能够运用计算机强大的运算能力和庞大的数据库，可以加快已知或未知成分的指认，弥补了手动建立化合物数据库的不足。基于LC-MS/MS结合MN技术在对于组成复杂的中药复方化学成分以及有效成分含量变化方面的研究有显著优势。胡静[48]采用UPLC-Q-TOF-MS技术结合诊断离子与MN分析策略，对当归补血汤的化学成分进行了表征，结果表明，酒当归与炙黄芪配伍后当归补血汤的化学成分会发生明显变化，与2个单味中药相比，有13个化学成分仅在当归补血汤中鉴别到，为其进一步的药效作用机制提供依据。

随着现代分析技术的快速发展，LC-MS/MS结合MN技术在单一及复方植物提取物成分检测领域得到广泛应用，表1归纳了LC-MS/MS结合MN在植物提取物及中药复方成分检测中的应用的文献。

表1 LC-MS/MS结合MN在植物提取物及中药复方成分检测中的应用

3 LC-MS/MS结合MN在饲料添加剂领域面临的挑战

基于LC-MS/MS结合MN技术已广泛应用于微生物、海洋生物等天然产物的研究，但此技术在天然植物成分分析及质量控制等方面仍存在一些问题：1)目前GNPS数据库收录的数据以来源于微生物和海洋生物的化合物居多，关于中草药化学成分的收录相对较少，对饲用植物提取物的发展造成了一定的局限性；2)不能区分中草药化学成分中的立体异构和位置异构，这将限制质谱技术在成分鉴定方面的发展；3)MN对于分析尚未报道过的新化合物是有难度的，仍需要结合其他分析技术确定化合物结构信息[30]。基于上述问题，丰富GNPS数据库成为亟待解决的问题，此外，将LC-MS与离子淌度[49-51]联用或者采用能量分辨质谱[52]可有效分辨同分异构体，将MN与多种分析方法整合运用，可有效弥补其弊端。

4 小结与展望

目前“全面禁抗”已成为大势所趋。饲用植物提取物成为“替抗”产品已经凸显其优势，例如苜蓿提取物、紫苏籽提取物、杜仲提取物等已被列入饲料添加剂品种目录。但饲用植物提取物如何发挥药效还需回归到其用法用量上。因此，制定规范的含量测定方法及质量控制标准具有重要的意义。近年来，LC-MS/MS技术因其分离性能强、准确度高等特点，已成为中草药成分分析的主流技术；MN则通过计算质谱数据之间相似度大小，将所有数据整合到1张可视化网络图谱中，可直观显示化学成分之间的相似度大小及结构类型，也可以对不同来源样品中的成分进行聚类及可视化差异分析。将LC-MS/MS技术与MN结合，实现了饲用植物提取物中活性成分的快速定性定量分析，可为饲用植物提取物的成分分析及质量控制标准规范化提供重要的参考。