基于稳定同位素的葡萄酒掺糖鉴别技术研究进展

李信萍，刘亚新，齐鹏宇，康天浩，谭丹，马雯，张昂*

（1. 宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021；2. 河北省葡萄酒质量安全检测重点实验室，河北秦皇岛 066000；3. 秦皇岛海关技术中心，河北秦皇岛 066000）

葡萄酒作为一种营养丰富的低酒精度饮料酒，适量饮用可以养颜益寿，防治心血管等疾病，深受消费者的青睐。随着我国葡萄酒市场日渐繁荣，葡萄酒的消费量呈快速增长趋势[1]。在经济利益驱动下，市场上葡萄酒掺假现象时常发生，一些不法生产商在葡萄酒酿造过程中，通过掺外源糖、外源水等手段来调整酒精度[2]。这些行为不仅侵犯了消费者的权益，扰乱葡萄酒市场的秩序，同时也损害了葡萄酒行业的形象[3]。目前国内外针对葡萄酒掺伪鉴别的方法多种多样，其中最行之有效的当属利用各种稳定同位素建立的鉴别技术。王广浩[4]利用乙醇同位素分析-同位素比质谱法（Ethanol Isotope Measurement-Isotope Ratio Mass Spectrometry, EIMIRMS）和点特异性天然同位素分馏核磁共振（Specific Natural Isotope Fractionation of Nuclear Magnetic Resonance, SNIF-NMR）测定葡萄酒样品中δ2H值来鉴别葡萄酒中外源糖的添加，发现葡萄酒样品中乙醇不可交换位点δ2H值被用来鉴别掺糖葡萄酒。谭梦茹等[5]采用元素分析-同位素质谱仪（Elementary Analyzer-Isotope Ratio Mass Spectrometers，EA-IRMS）对不同种类纯正葡萄汁的糖、有机酸δ13C值进行测定，初步建立了纯正葡萄汁中δ13C值的数据库，根据糖和有机酸δ13C值间的差异鉴别葡萄汁中C4植物糖的掺假。王道兵等[6]建立了连续流稳定同位素比质谱仪（Gas BenchⅡ-Isotope Ratio Mass Spectrometers，Gas BenchⅡ-IRMS）测定葡萄酒水中氧同位素组成的在线分析方法来鉴别掺水葡萄酒。本文综述了稳定同位素技术在葡萄酒掺糖鉴别中的研究进展，比较了稳定同位素技术在葡萄酒掺糖鉴别中的优缺点，重点阐述了碳、氢稳定同位素在葡萄酒掺糖鉴别中的应用，旨在为我国葡萄酒真实性鉴别建立数据库提供参考，以期促进葡萄酒真实性鉴别的深入研究。

1 稳定同位素技术概述

同位素是指含有相同质子数、不同中子数的一类元素，分为C、H、O、N等轻同位素和Pb、Sr等重同位素[7]。自然界中，生物体会不断与外界环境进行物质交换，稳定同位素会在物理、化学、生化反应过程中发生同位素分馏。外界环境条件不同、自身代谢模式的差异，都会导致不同来源的生物体内稳定同位素的自然丰度存在差异，这种差异可以作为鉴别食品真实性的有效指标[8-9]。

目前，稳定同位素技术是国内外应用于食品真实性鉴别研究较多的技术，其中主要用来鉴别葡萄酒掺糖的稳定同位素联用技术，见表1。

表1 稳定同位素联用技术的原理及优缺点Table 1 Principle and advantages and disadvantages of stable isotope combination technology

C、H、O是最常用的几种稳定同位素，也是组成生物体含量的主要元素，属于原子水平信息，不会随着外源物的添加而改变，也不可进行人为更改[10-11]。外界环境（气候条件、地理位置、土壤来源等）条件和自身代谢模式的差异，都会使不同来源生物体内稳定同位素自然丰度存在差异[12-16]。C同位素作为最重要的生命元素，自然界中以12C和13C两种形式存在，其组成与光合碳代谢途径息息相关[17-18]。温度、降水量和CO2浓度都是影响C同位素丰度的主要因素[19-20]。除此以外，压力、光照、大气压等其它因素也会影响C同位素丰度[21]。H、O同位素以单质和化合物的形式遍布全球。H同位素主要有1H、2H、3H三种，其中1H、2H常被用于食品的真实性分析[4]。由于H同位素质量小，在化学反应中更容易发生分馏，温度、降水、温度、离海距离等都会影响它的丰度[22]。O同位素主要有16O、17O、18O三种，地下水、植物组织自身的蒸腾作用、生产过程中的浓缩都会影响O同位素丰度改变[23-24]。植物体中稳定C、H、O同位素因质量不同，在一些环境因素作用下产生分馏，使不同来源植源性食品的同位素自然丰度产生差异，这种差异可用来鉴别食品的真实性[25-26]。

2 稳定同位素技术在葡萄酒掺糖鉴别中的应用

随着消费者对食品安全要求的与日俱增，葡萄酒作为食品中的重要组成部分，真实性问题也逐渐进入消费者视野[44]。在葡萄酒真实性领域中，稳定同位素技术是目前国内外应用于葡萄酒掺糖鉴别研究较多的技术手段之一[10]。其中，C、H稳定同位素是最常用于葡萄酒真实性鉴别的两种同位素，目前已在葡萄酒真实性鉴别中得到了广泛的研究和应用，见表2。

表2 C、H稳定同位素在葡萄酒掺糖鉴别中的应用Table 2 Application of C and H stable isotopes in wine sugar identification

2.1 碳同位素在葡萄酒掺糖鉴别中的应用

目前稳定同位素用于鉴别葡萄酒掺糖已成为研究热点[14,62]。其中，C稳定同位素被用于葡萄酒掺糖鉴别的依据是C4和C3两种不同植物光合作用代谢途径所得产物δ13C值的差异[5]。但由于δ13C值不同的外源糖较多，建立数据库工作量较大，需要利用葡萄酒发酵过程中产生的副产物δ13C值间的差异进行判定，如甘油、有机酸、氨基酸等与乙醇结合鉴别葡萄酒发酵过程中外源糖的添加[63]。这些不同来源的碳是否被混合，可通过比较同位素δ13C值之间的差异来鉴别[64]。

2.1.1 乙醇

葡萄酒中的乙醇是由果实中糖分在无氧条件下，酵母菌通过对糖的不完全分解而产生的，故乙醇δ13C值与糖组分中δ13C值具有同源性，但由于各种因素的作用，每个产地葡萄果实中糖分含量不同，其发酵产生的乙醇δ13C值也有差异[65-66]。在葡萄汁发酵过程中添加外源糖，会引起乙醇δ13C值改变，因此，乙醇δ13C值可用于追溯葡萄汁发酵时有无外源糖的掺入[67]。

Martinelli等[49]采用IRMS技术测定了巴西和美国起泡葡萄酒乙醇δ13C值来鉴别葡萄酒的掺糖情况，该技术仅鉴别出了部分葡萄酒样添加了C4植物糖，但对于混合类型的植物糖仍需结合其它化学方法来进行鉴别。李学民等[56]采用EA-IRMS和LC-IRMS技术测定国内外40款葡萄酒样品中乙醇δ13C值，发现这两种技术的检测结果差值具有很强的相关性，且采用EA-IRMS技术测定葡萄酒乙醇δ13C值，具有较好的精密度和准确度，为葡萄酒掺假鉴别研究奠定了基础。相比之下，Cabanero等[68]利用HPLC-IRMS和GC-IRMS技术，通过优化葡萄酒基质中分离乙醇的柱温度、流动相、流量和注入方式等参数，分析了23个不同来源的葡萄酒样品乙醇δ13C值。研究发现，优化仪器参数后能够改进现有的葡萄酒掺假检测方法，并克服了样品制备的困难。此外，与传统方法相比，HPLC-IRMS技术耗时少、操作简单、重复性好、无同位素分馏，可用于葡萄酒中乙醇δ13C值的高精度测量，被认为是一种快速、准确、简单的葡萄酒掺糖检测方法。

2.1.2 甘油

甘油是葡萄酒发酵过程中的主要副产物[69]。在酒精发酵开始时，参加3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸这一反应所需的辅酶Ⅰ（NAD），是通过磷酸二羧丙酮的氧化作用来提供的，甘油伴随着这一氧化作用产生。

葡萄酒数据库的建立需要大量数据，这些数据的收集需要投入大量的人力和时间。为此，Cabanero等[54]利用HPLC-co-IRMS技术分析葡萄酒中乙醇和甘油δ13C值之间的差异来鉴别葡萄酒的真实性。结果表明，该技术简单、快速，用乙醇和甘油δ13C值之间的差异可以作为鉴别葡萄酒真实性的依据，但两者之间的差异也会因产地和葡萄酒类型有所不同。Calderone等[37]采用GC-CIRMS技术对欧盟数据库中170种葡萄酒样品中甘油δ13C值进行分析，认为该技术成功地解决了在大量葡萄酒样品中添加甘油的问题，且样品制备简单，重复性好。但不足之处是难以将葡萄酒中的甘油从其它浓缩的成分中完全分离出来，需要考虑蒸馏、萃取和溶剂稀释等前处理过程中C同位素的影响[37-38]。李学民等[70]采用LC-IRMS技术测定葡萄酒中甘油和乙醇δ13C值鉴别葡萄酒掺假问题，结果表明，该方法的精密度可达0.015%～0.026%，有较好的重现性，是可以同时测定葡萄酒中甘油和乙醇δ13C值的首选方法，既克服了样品处理技术的困难，同时提高了检测速度，达到了鉴别葡萄酒真实性的目的。

2.1.3 有机酸

苹果酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸等作为葡萄酒中主要的有机酸，对葡萄酒品质的优劣起着重要作用[71-72]。其中酒石酸是葡萄酒中特有的有机酸，占葡萄酒总酸的四分之一，也是酸度最高的有机酸，对葡萄成熟和葡萄酒发酵起着重要作用；苹果酸是葡萄酒发酵的重要中间产物，是生物体代谢三羧酸循环及其支路乙醛酸循环的中间产物，具有巨大的生物学作用；柠檬酸存在于葡萄原料中；葡萄酒酿造过程中的苹果酸-乳酸发酵会产生另一种重要的有机酸——乳酸，乳酸会影响葡萄酒的成熟，至葡萄酒发酵结束[73]。

Weber等[47]采用IRMS技术对57种来自莱茵普法尔兹地区不同年份葡萄酒中的乙醇、L-戊二酸、L-酒石酸和柠檬酸的δ13C值进行测定，建立有机酸与糖、乙醇之间的同位素相关性，鉴别葡萄酒掺假。结果表明：糖δ13C值与乙醇δ13C值之间存在良好的相关性，并发现葡萄酒中乙醇和柠檬酸δ13C值有紧密相关性，可以将葡萄酒中的有机酸作为内标物质结合乙醇、糖δ13C值来鉴别葡萄酒中外源糖的掺入。谭梦茹等[5]采用EA-IRMS技术对152个不同产区纯正葡萄汁的糖和有机酸δ13C值进行测定，初步建立了纯正葡萄汁的同位素数据库，分析了纯正葡萄汁应满足糖和有机酸δ13C值的限定要求。依据这个限定条件，对市售葡萄汁、自制掺入外源糖、有机酸的葡萄汁中糖和有机酸δ13C值进行测定，分析两者δ13C值的差异。结果表明，采用该技术检出了掺入C4植物糖和有机酸的样品，且在掺假鉴别的灵敏度方面显示了很大优势，有较好的应用前景。

2.1.4 氨基酸

葡萄汁发酵过程中，氨基酸由酵母菌自溶而形成，是酒精发酵结束后乳酸菌的营养物质。有研究表明，采用GC-C-IRMS测定葡萄酒中脯氨酸和糖组分的δ13C值是一种新的分析工具，可以支持和改进葡萄酒中添加外源糖的检测[60]。

Perini等[60]开发了一种能够鉴别葡萄酒掺糖和确定加糖量的新方法，采用EA-IRMS技术分析了葡萄汁发酵过程中提取的糖δ13C值，采用GC-C-IRMS技术分析了萃取和衍生化后脯氨酸的δ13C值。结果表明，葡萄酒中糖和氨基酸的同位素组成之间存在相关性，在葡萄汁发酵过程中添加外源糖，只能改变糖组分的δ13C值，而不改变脯氨酸的δ13C值。因此，糖组分和脯氨酸δ13C值的相关性分析可以被认为是一个可靠的内部标准，来鉴别外源糖的添加。

2.1.5 葡萄糖、果糖

葡萄糖和果糖作为葡萄酒中的重要组成成分，是由蔗糖预先经酵母菌本身分泌的转化酶或葡萄果实中的转化酶水解而产生。

Guyon等[31]通过HPLC-co-IRMS技术测定了20款来自法国的葡萄酒样品中的葡萄糖、果糖、甘油和乙醇δ13C值，鉴别半甜型葡萄酒中糖的真实性。结果表明：该技术实现了葡萄糖、果糖、甘油和乙醇的完全分离和δ13C值测定，外源葡萄糖、果糖或甘油的添加均会使δ13C值发生变化，且该方法对添加物的检出限低至2.5 g·L-1，具有良好的再现性和重复性。通过比较δ13C值之间的差异发现，该技术可以鉴别葡萄酒中C4植物糖的添加，对C3植物糖和葡萄酒中一些有机酸的鉴别也提供了宝贵信息。

2.2 氢同位素在葡萄酒掺糖鉴别中的应用

葡萄酒中的同位素以2H/1H、13C/12C、18O/16O为主，在葡萄汁发酵前，添加外源糖进行发酵，会影响发酵后酒精中氘（D）的分布，氘同位素会在甲基位（CH2DCH2OH）、次甲基（CH3CHDOH）、羟基位（CH3CH2OD）和水分子（HOD）4个位点重新分布，这种分布特点被称为点特异性同位素分布[74]。有研究表明，葡萄酒乙醇分子中甲基位(D/H)Ⅰ含量很大程度上取决于发酵糖的氘含量，它代表着糖的植物来源[64]。

在葡萄酒真实性鉴别中，SNIF-NMR是第一个被欧盟委员会用于分析葡萄酒乙醇分子中δ2H值差异的技术，是推进葡萄酒真实性鉴别的一个里程碑，为鉴别葡萄酒的真实性做出了重大贡献[42,44]。Martin等[75]在上世纪80年代采用该技术分析乙醇中δ2H对谷物酒和果酒的掺糖进行鉴别，Markus采用SNIF-NMR在葡萄酒发酵前加入不同类型外源糖，通过测定乙醇中(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ含量，根据含量变化有效鉴别出掺入单一外源糖的类型，但对于混合植物类型的外源糖却无法鉴别。相比之下，Kosir等[76]同时采用IRMS技术和SNIF-NMR结合主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）、聚类分析（Cluster Analysis，CA）等化学计量学方法测定斯洛文尼亚3个产区中葡萄酒中乙醇δ13C值和δ2H值，有效鉴别了葡萄酒发酵过程中不同类型外源糖的掺入。2008年，蒋露等[43]首次采用SNIF-NMR测定葡萄酒乙醇(D/H)Ⅰ、(D/H)Ⅱ。结果表明，乙醇分子中不同位点H含量可用来鉴别葡萄酒在酿造过程中是否进行了加糖操作。Smajlovi等[39]2013年采用EIM-Module-IRMS测定掺糖葡萄汁发酵蒸馏样品与真实葡萄汁发酵蒸馏样品乙醇δ2H值来鉴别外源糖的掺入，结果表明，该方法与SNIF-NMR相比，能够以更高的准确性来鉴别葡萄酒中外源糖的添加，并能检测出无指定来源葡萄酒的非法生产行为。2019年，采用EIM-Module-IRMS对42个掺假葡萄酒样品中乙醇δDn值、水δ18O值和乙醇δ13C值进行测定，结果表明，使用葡萄酒乙醇中δDn值分析参数可以有效鉴别非法葡萄酒生产实践中外源糖的掺入和乙醇的来源[40]。王广浩等[4]模拟真假葡萄酒样，蒸馏后采用EIM-Module-IRMS和SNIF-NMR分析酒样中乙醇不可交换δ2H值和(D/H)Ⅰ含量，鉴别葡萄酒中外源糖的添加。结果证明，两种方法都能够实现葡萄酒中外源糖的鉴别，但在现有蒸馏系统的条件下EIM-Module-IRMS比SNIF-NMR更适合鉴别葡萄酒中外源糖的掺入，且该技术具有鉴别能力高、对仪器要求低、测定时间短、测定步骤简单、样品消耗量少等优点。

稳定同位素联用技术与其它化学计量法联合使用对同位素进行分析，能够有效降低葡萄酒掺糖判定误差，提高葡萄酒掺糖的鉴别效率，已成为解决葡萄酒掺糖的强有力手段。这些联用技术对实现我国葡萄酒市场的有效监管、促进葡萄酒市场向规范化发展具有极其重要的指导意义[64]。

3 结语

GB/T 15037—2006《葡萄酒》作为葡萄酒行业最重要、最基础的标准，但与真实性相关的水、糖、乙醇等添加方面没有明确的要求。鉴于此，在葡萄酒真实性领域中，国家制定了与葡萄酒质量相关的标准并拓展了鉴别掺假的技术，其中，稳定同位素联用技术在葡萄酒掺糖鉴别中展现出独特的优势。针对葡萄酒中不同类型外源糖的添加，稳定同位素联用技术稳定性相对较好，能有效提高鉴别准确率，能准确快速对样品δ13C值进行测定，对鉴别葡萄酒掺假做出了巨大贡献。针对掺入单一类型的C4植物糖能够进行有效鉴别，但对于掺入与葡萄光合原理相同的C3植物糖，因为两者的δ13C值相近，没有明显的差异，不能有效地进行鉴别，可借助SNIFNMR测定葡萄酒中乙醇不同位点H的含量来鉴别。

稳定同位素技术结合尖端、高效的化学方法鉴别葡萄酒真实性已在国际上认定为非常有效的分析工具并在实际应用中取得了一些效果。但对于形成完整、行之有效的鉴别技术目前仍存在以下几方面的问题：（1）同位素值不同的外源糖类型较多、掺假的方式多样性、掺假物质的复杂性逐渐增加，导致使用单一稳定同位素技术对葡萄酒掺糖进行鉴别存在一定的难度和局限性；（2）当葡萄酒中掺入外源糖的稳定同位素值与葡萄酒的稳定同位素值特别接近时，单独使用该方法进行鉴别存在一定的困难，需借助其他的鉴别方法加以辅助；（3）同位素质谱仪设备和标准品价格昂贵限制了该技术在葡萄酒掺糖鉴别中的发展和应用，所以不断开发仪器的应用，降低检测成本，才能在葡萄酒真实性鉴别中得到更广泛的应用。

未来，随着掺假物质的复杂化，掺假手段的多样化，采用单一技术很难对葡萄酒掺糖进行全面准确地鉴别。因此，为了提高稳定同位素技术在葡萄酒掺假鉴别方面的准确性和有效性，采用多技术联用，并在此基础上结合一些化学计量学方法，建立覆盖面更全的葡萄酒鉴别模型数据库，是发展稳定同位素技术在葡萄酒真实性分析领域应用的必然趋势，也将为我国葡萄酒市场乃至全世界葡萄酒市场健康发展提供有力保障。