高效液相色谱法测定药品胶塞中硫磺和7种抗氧剂含量及迁移
2022-12-08韩海燕吴红洋唐韵熙范能全
李 莎，韩海燕，吴红洋，唐韵熙，王 巍，范能全△
（1.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121；2.重庆市涪陵食品药品检验所，重庆 408000）
关键字：高效液相色谱法；胶塞；抗氧剂；硫化剂
药用胶塞弹性和稳定性良好，广泛用于注射剂的密封［1］。但在药品的贮存过程中，胶塞因与药品长期、直接接触，易产生与药物的相容性问题，从而影响药品质量，甚至对人体产生毒副作用［2］。目前，许多医药类胶塞中可检测到其生产所用主要硫化剂硫磺的存在［3］。硫化剂会改变繁殖周期，影响新生儿发育，还可能增强致癌基因的表达［4-7］。因此，有必要对硫磺等硫化剂含量进行考察及控制，以保障用药安全。胶塞配方中常用的抗氧剂按结构分类主要有受阻酚类及亚磷酸酯类等，受阻酚类主要包括2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、抗氧剂1076、抗氧剂1010、1，3，5-三甲基-2，4，6-（3，5-二叔丁基-4-羟基苯甲基）苯（抗氧剂1330）等，亚磷酸酯类主要包括抗氧剂168等［8］。抗氧剂超出一定限量，会损伤人体肝、脾、肺等器官［9］，且部分易降解，其降解产物毒性也较大［10］。近年来，已有研究涉及抗氧剂和药品包装材料的相容性［11-16］，高效液相色谱（HPLC）法虽可检测抗氧剂但已有研究涉及的种类较少，液相质谱联用法可检种类较多，但检测成本较高。为此，本研究中以胰岛素注射液模拟注射用液，建立了同时测定药用胶塞中上述7种抗氧剂和硫磺含量的HPLC法，并结合每日允许暴露量（PDE）评估结果的安全性。现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；XPE205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；HH-21-8型水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；VX-95型高压灭菌器（德国Systec公司）；Milli-Q Advantage A10型超纯水机（法国Merck Millipore公司）。
1.2 试药
抗氧剂1310对照品（CAS号20170-32-5，批号为P1437031）、242对照品（CAS号96-76-4，批号为P1226121），均购自Adamas Reagent Co，Ltd，纯度均大于98%；BHT对照品（阿拉丁试剂公司，CAS号128-37-0，批号为B1926023，纯度＞99.7%）；硫磺对照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，CAS号7704-34-9，批号为106536，纯度＞99.0%）；抗氧剂1010对照品（CAS号6683-19-8，批号为007WX5）、330对照品（CAS号1709-70-2，批号为006C27）、1076对照品（CAS号2082-79-3，批号为003V02）、168对照品（CAS号31570-04-4，批号为002CTK），均为欧洲药典标准品，纯度均为100%；注射器用溴化丁基橡胶塞活塞（简称胶塞，Datwyler Pharma Packaging Belgium公司，编号为B013）；胰岛素注射液（重庆宸安生物制药有限公司，编号为A003，A004，A005，每日最大用量1 mg）；甲醇、乙酸均为色谱纯，二氯甲烷为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%乙酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min时40%A→80%A，5～15 min时80%A→95%A，15～16 min时95%A→100%A，16～40 min时100%A，40～41 min时100%A→40%A，41～55 min时40%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：35℃，进样量：20 μL。
2.2 溶液制备
混合对照品溶液：分别称取抗氧剂1310，242，1010，330，1076，168，BHT及硫磺对照品0.010 93，0.011 05，0.010 70，0.010 82，0.010 47，0.010 58，0.010 40，0.010 91 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇定容，制得质量浓度约为100 μg/mL的混合对照品溶液。
供试品溶液：以0.2 g/mL的比例在胶塞中加入胰岛素注射液，121℃下高压灭菌1 h，提取胶塞，得提取液；取15 mL置分液漏斗中，加二氯甲烷15 mL振摇提取30 min，取二氯甲烷层挥干，加入无水乙醇定容至15 mL，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
加标供试品溶液：取前述提取液5 mL，置分液漏斗中，加混合对照品溶液1 mL，加二氯甲烷5 mL振摇提取30 min，取二氯甲烷层挥干，加入无水乙醇定容至5 mL，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
阴性对照品溶液、空白溶剂：取剪碎后的胶塞2.005 4 g，精密称定，加二氯甲烷10 mL超声［功率为500 W，频率为40 kHz，温度为（25±2）℃］处理30 min，取二氯甲烷层挥干，加入无水乙醇定容至10 mL，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。同法（不加胶塞）制得空白溶剂。
2.3 方法学考察
专属性试验：精密吸取2.2项下5种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与混合对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，阴性对照无干扰。详见图1。
图1 高效液相色谱图1.1310 2.242 3.BHT 4.Sulphur 5.1010 6.330 7.1076 8.168A.Mixed reference solution B.Test solution C.Spiked test solution D.Negative reference solution E.Blank solventFig.1 HPLC chromatograms
精密度试验：取2.2项下加标供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件，连续进样测定6次，记录峰面积。结果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法精密度良好。
重复性试验：取2.2项下提取液适量，按2.2项下方法制备加标供试品溶液溶液，共6份，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重复性良好。
加样回收试验：取2.2项下加标供试品溶液适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。
表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）
2.4 耐用性考察
将流速从1.00 mL/min分别调至0.95 mL/min和1.05 mL/min；柱温从35℃分别调至33℃和37℃，其他色谱条件均保持不变，进样测定，记录色谱图。结果表明，小幅度改变色谱条件能满足试验要求，耐用性良好。
2.5 样品含量测定
取2.2项下阴性对照品溶液与供试品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，外标法计算各抗氧剂及硫磺含量。结果胶塞中检出抗氧剂1310，1 010，1 076，168和硫磺，样品药物中检出抗氧剂1010和硫磺。详见表2。
表2 样品及胶塞中抗氧剂和硫磺含量测定Tab.2 Content determination of antioxidant and sulphur in samples and rubber stoppers
2.6 安全性评价
计算分析表观效应阈值（AET）。AET=PDE/MDI，式中，PDE为关注物质每日允许最大摄入量（μg/d），MDI为每日最大摄入量（瓶）。
对于已知有致突变性、致癌性的化学物质，国际人用药品注册技术协调会（ICH）指导原则M7，从半数中毒剂量（TD50）线性外推的方法设立可接受摄入量。通过将TD50值除以50 000以线性外推至十万分之一的发生率（即终生风险水平）。在化学结构上相似的化合物，可按类别制订可接受摄入量。
以抗氧剂1310为例，查阅毒理学关注阈值（TTC）得知，其对于大鼠的TD50为540 mg/（kg·d），成人平均体质量按50 kg计，计算得到抗氧剂1310人体可接受摄入量为540 μg/d。根据各抗氧剂和硫磺的PDE值及样品每日最大使用量计算得到最大允许含量，由此计算出提取/迁移试验中AET，结果见表3（ECHA为欧盟化学品管理局）。
表3 抗氧剂和硫磺非肠道给药途径的PDE值及来源Tab.3 PDE value and source of antioxidant and sulphur by parenteral administration route
3 讨论
预试验中，取混合对照品溶液进行稀释，选择质量浓度低于360 μg/mL［以硫磺、抗氧剂及降解产物中最小的50%仪器AET计算，抗氧剂1310限度=540（μg/d）÷3（mL）×4（mg）×1（mg/d）×50%=360 μg/mL］的混合对照品溶液（100 μg/mL）进样，结果其信噪比（S/N）值均大于10，能满足试验对检测灵敏度的要求。并考察了胰岛素注射液中抗氧剂和硫磺迁移情况及胶塞中提取抗氧剂和硫磺的检测限，结果试验中8种待测成分对于迁移样品或胶塞提取的方法检测限均小于108.3 μg/mL，低于各自50%AET。
综上所述，本研究中建立了同时测定胰岛素注射液成品的溴化丁基胶塞及其提取物中硫磺及7种抗氧剂含量的HPLC法，该方法专属性好、灵敏度高，重复性、精密度好，结果准确、可靠，同时发现，检测出的胶塞中各成分含量和药品迁移值远低于注射途径的PDE值，迁移的抗氧剂和硫化剂基本不影响药品安全性。
