银翘解毒口服液中山银花鉴别方法研究*

朱泽兵，何世新

（重庆市万州食品药品检验所·三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404100）

银翘解毒口服液，由金银花、连翘、薄荷等9种中药材组方，有辛凉解表、清热解毒等功效，主要用于治疗风热感冒、发热头痛、咳嗽口干、咽喉疼痛等［1-4］。2000年版《中国药典（一部）》将忍冬Lonicera japonicaThunb.，灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、华南忍冬Lonicera confusaDC.，黄褐毛忍冬Lonicera fulvotmentosaHsu et S.C.Chen）共同归属于金银花，但2005年版《中国药典》及以后版本将忍冬归属为金银花，其余4种忍冬均归属山银花［5-6］。银翘解毒颗粒中金银花的投料不合格率较高［7］，使用山银花代替金银花仍是较普遍现象，鉴别关键是找出两种药材中的特征性标志物质，即灰毡毛忍冬皂苷乙［8-10］。此外，2020年版《中国药典（一部）》中银黄类制剂中山银花的鉴别均以灰毡毛忍冬皂苷乙为特征性成分［11］。为此，本研究中以灰毡毛忍冬皂苷乙为特征性成分，采用高效液相-质谱联用（HPLC-MS）法对银翘解毒口服液中的金银花及山银花进行了鉴别，并与现行高效液相色谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法进行比较。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Shimadzu-20A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；QE Focus型超高效液相色谱串联质谱仪（美国Thermo Fisher公司）；SDLA-B-1101型超纯水机（重庆圣德利医疗器械研究有限公司）；AB204S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度为万分之一）；MSE225S型分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

29批银翘解毒口服液购自不同省市的不同药店，涉及全国22家生产企业，规格为每支10 mL（样品来源与批号见表1）；灰毡毛忍冬皂苷乙对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111814-201604，含量94.4%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。金银花和山银花药材均经重庆市万州食品药品检验所郭娅中药师鉴定为正品。

表1 样品来源与批号Tab.1 Source and batch numbers of samples

2 方法与结果

2.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为Thermo C18柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B，含5.0 mmol/L乙酸铵），梯度洗脱（0～2 min时10%A，2～4.5 min时10%A→90%A，4.5～6 min时90%A，6～6.01 min时90%A→10%A，6.01～8 min时，10%A）；流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；进样量为5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），质谱多反应监测（MRM），正离子模式，电离电压（IS）为3.2 kV，鞘气流速为30 mL/min，辅助气流速为10 mL/min，离子化温度（TEM）为350℃。灰毡毛忍冬皂苷乙的定性离子对m/z1 421.7/1 097.6，碰撞能量1（CE1）为107 eV，定量离子对为m/z1 421.7/493.1，碰撞能量2（CE2）为121 eV，去簇电压（DP）为250 V。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含灰毡毛忍冬皂苷乙0.7 mg的对照品溶液。

对照药材溶液：分别取金银花药材和山银花药材，按2020年版《中国药典》金银花处理方法处理，制得单一对照药材溶液。

供试品溶液：取样品2 mL，置50 mL容量瓶中，加入50%甲醇适量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，加50%甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按银翘解毒口服液处方和工艺制备缺金银花及山银花的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1项下试验条件进样测定，记录色谱图。结果，阴性对照品溶液色谱在与灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液色谱保留时间相同处无干扰峰，表明专属性良好。详见图1。

图1 质谱图1.Macranthoidin BA.Reference solution B.Reference material solution of Lonicerae Flos C.Reference material solution of Lonicerae Japonicae Flos D.Test solutionE.Negative reference solutionFig.1 Mass spectrograms

线性关系考察：取对照品溶液适量，用50%甲醇溶液稀释制成质量浓度分别为5，10，20，50，100，200 ng/mL的系列对照品溶液。精密量取5 μL，按2.1项下试验条件进样测定，记录峰面积，以灰毡毛忍冬皂苷质量浓度对数值（X）为横坐标、峰面积对数值（Y）为纵坐标进行线性回归，回归方程Y=1 805.210 03X+823.135 72（r=0.999 90）。结果表明，毛毡忍冬皂苷质量浓度在5.299 86～211.994 29 ng/mL范围内与峰面积对数值线性关系良好。

检测限与定量限考察：精密吸取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液倍比稀释，按2.1项下试验条件进样测定，以信噪比（S/N）为3∶1和10∶1时的质量浓度分别记作检测限和定量限。结果分别为1.50 ng/mL及5.0 ng/mL。

精密度试验：取2.2项下对照品溶液适量，按2.1项下试验条件进样测定，重复进样6次，记录离子丰度。结果的RSD为0.93%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S1）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，3，6，9，12，24，36，48 h时按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度。结果的RSD为3.47%（n=8），表明供试品溶液在室温下放置48 h内稳定。

重复性试验：取样品（编号为S1）各6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度并计算含量。结果毛毡忍冬皂苷含量为每片2.31 mg，RSD为1.70%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（编号为S1）适量，加入对照品溶液3 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，并按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度并计算加样回收率。结果平均加样回收率为93.66%，RSD为2.41%（n=6）。

2.4 样品含量测定

取29批样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，均取2份。并按2.1项下试验条件进样测定，记录离子丰度，计算样品含量，并与HPLC-ELSD法比较，结果见表2 。HPLC-ELSD法及HPLC-MS法分别检测出5批次及7批次不符合规定的样品。且2种方法测定结果的RSD≤2.5%，表明2种方法均具有较好的兼容性，均可用于银翘解毒口服液中山银花投料的鉴别，后者标准更严格。

3 讨论

目前，金银花制剂中山银花的鉴别主要均是以灰毡毛忍冬皂苷乙为特征性物质，采用薄层色谱法和HPLC-ELSD法进行鉴别［11-15］。陆静娴等［7］以灰毡毛忍冬皂苷乙为特征性物质，采用HPLC-ELSD法测定了189批次银翘解毒颗粒，其中有22批次样品仅达到检测限而未达到定量限但判定为符合规定，表明HPLCELSD法在测定金银花中药制剂中的灰毡毛忍冬皂苷乙含量时，其检测灵敏度与目标值还有一定差距。2020年版《中国药典（一部）》规定，山银花中灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙总含量不得低于5.0%［12］，以山银花中可允许的灰毡毛忍冬皂苷乙的最低限量为标准计算，当每1 mL银翘解毒口服液中山银花含量为0.15×10-6时，就能被检测到，灵敏度较高。

方法学考察结果表明，HPLC-MS法的线性关系、精密度、重复性、稳定性和加样回收率均良好，测定样品中灰毡毛忍冬皂苷乙的结果真实可靠，重复性好，可用于银翘解毒口服液中山银花投料的鉴别。与HPLCELSD法检测结果比较，HPLC-MS法抽检样品不合格率更高，即后者鉴别能力更强，标准更严格。24.14%的不合格率表明部分企业仍以山银花替代金银花生产银翘解毒口服液。针对这些问题，应不断提升银翘解毒口服液中山银花的鉴定技术，加强银翘解毒口服液中山银花投料的监管。