非小细胞肺癌免疫治疗生物标志物研究进展

江昌 易玲 高翔 张洪涛 张树才

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率也居恶性肿瘤首位。既往治疗主要是以铂类为基础的双药化疗，但传统化疗不良反应多且疗效有限。免疫治疗开启了肿瘤治疗的新时代，为肿瘤的治疗模式带来了革命性改变。尽管免疫治疗已经取得突破性进展，但仅有一部分患者产生应答并从中持久性获益。在NSCLC中，不区分治疗人群，免疫治疗的客观缓解率（objective response rate, ORR）在20%左右[1,2]，即使在程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）表达大于50%的人群中，ORR也不到50%[3,4]。因此，为了更好地提高免疫治疗疗效，达到精准治疗的目的，肿瘤免疫治疗生物标志物的研究和探索备受重视。本文聚焦NSCLC免疫治疗相关的生物标记物，并对近年NSCLC免疫治疗生物标志物研究现状和进展进行综述，以便对其有更加深入、更加全面的认识，为免疫治疗的临床实践提供参考。

1 PD-L1表达

PD-L1是一种免疫检查点分子，与T细胞表面的程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death-1, PD-1）结合后可以抑制T细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进肿瘤发展[5]。多项临床研究[4,6,7]表明，PD-L1的表达与NSCLC患者的ICIs治疗结局相关。Keynote-024和Keynote-042研究均为多中心、III期随机对照试验，旨在比较Pembrolizumab与含铂化疗在无表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）驱动基因突变的初治NSCLC中的疗效。Keynote-024研究[4,8]将PD-L1肿瘤细胞阳性比例分数（tumor proportion score, TPS）≥50%患者纳入研究，与含铂化疗组相比，Pembrolizumab组具有更高的ORR（44.8%vs27.8%）、更长的无进展生存期（progression-free survival, PFS）（10.3个月vs6.0个月；HR=0.50，95%CI：0.37-0.68）和总生存期（overall survival, OS）（30.0个月vs14.2个月；HR=0.63，95%CI：0.47-0.86）。2020年欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology, ESMO）年会上，Keynote-024研究[9]5年OS数据进行了更新，相较于化疗组，Pembrolizumab组具有更长的OS（26.3个月vs13.4个月），5年OS率也显著高于化疗组（31.9%vs16.3%）。Keynote-024试验的结果也使得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准Pembrolizumab作为驱动基因突变阴性且PD-L1 TPS≥50%的晚期NSCLC一线治疗方案。Keynote-042[3]将纳入研究人群拓展至PD-L1 TPS≥1%，研究结果显示Pembrolizumab组比化疗组具有更长OS（16.7个月vs12.1个月；HR=0.81，95%CI：0.71-0.93）；亚组分析发现PD-L1 TPS≥50%组OS获益显著（20个月vs12.2个月；HR=0.69，95%CI：0.56-0.85）；TPS 1%-49%亚组中，Pembrolizumab组OS未见明显获益。Pembrolizumab组内PD-L1 TPS≥50%的患者占比较高（299/637）及该群体较好的OS获益可能是整体分析中Pembrolizumab组OS获益的重要原因。Keynote-042研究进一步证实并巩固了Pembrolizumab在PD-L1高表达晚期NSCLC一线治疗地位；对于PD-L1 TPS 1%-49%的患者，Pembrolizumab单药治疗并不是一线治疗的最佳选择。

IMpower131将既往未经治疗的鳞状NSCLC患者按1:1:1的比例随机分配至Atezolizumab+卡铂/紫杉醇（A+CP）组、Atezolizumab+卡铂/白蛋白结合型紫杉醇（A+CnP）组、卡铂/白蛋白结合型紫杉醇（CnP）组。在PD-L1高表达亚组中，相较于CnP组，A+CnP组患者具有更长的PFS（10.1个月vs5.1个月；HR=0.41，95%CI：0.25-0.68）和OS（23.4个月vs10.2个月；HR=0.48，95%CI：0.29-0.81）。在PD-L1低表达和阴性亚组中A+CnP未见明显PFS和OS获益[7]。该研究数据表明，仅有PD-L1高表达亚组患者接受免疫联合化疗后PFS和OS可获益。

尽管PD-L1是FDA批准的首个用于ICI治疗的预测性生物标志物，其在临床应用中仍面临一些挑战。Checkmate017/057的研究结果，使Nivolumab被FDA批准用于NSCLC的二线治疗。与PD-L1 TPS≥1%的NSCLC患者可以从Pembrolizumab一线单药治疗获益不同，无论患者PD-L1表达与否，均能从Nivolumab二线单药治疗获益[10]。OAK研究[11]比较Atezolizumab与多西他赛在既往接受过治疗的NSCLC患者中的治疗效果，纳入患者不限病理类型和PD-L1表达状态。研究表明，无论PD-L1表达状态如何，Atezolizumab组均具有更长的OS。Keynote-189研究结果[12]显示，任何PD-L1表达状态下，非鳞NSCLC患者均能从Pembrolizumab联合化疗中获益。PD-L1表达对不同ICI、免疫单药或免疫联合化疗疗效预测具有不一致性，使其临床应用受到一定限制。除此之外，PD-L1的检测尚未标准化，有多种平台、多种抗体用于PD-L1检测，不同平台采用不同的评分系统评估PD-L1表达水平，且无严格的标准界定PD-L1的阴性和阳性[13]，而且，病理学家对PD-L1表达的评分在不同观察者之间的重复性较差[14]。免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是评估肿瘤组织PD-L1表达最常用的方法，但PD-L1的表达是一个动态过程，受γ干扰素（interferon-γ, IFN-γ）、化疗和放疗等多种因素影响[15]，IHC不能有效反映该过程；同时，PD-L1的表达除了在肿瘤组织内存在异质性，不同转移部位表达也存在异质性，肾上腺、肝脏和淋巴结转移灶中表达最高，而骨和脑转移灶中表达较低。因此，IHC并不能反映肿瘤组织真实的PD-L1表达状态[16]，影响了PD-L1预测准确性。据报道，IHC的预测准确率<30%[17]。不同部位PD-L1表达水平的预测价值也不同，肺或远处转移灶中PD-L1的表达水平与临床获益呈正相关，而在淋巴结转移灶的PD-L1表达水平与临床获益无关[18]。

2 肿瘤突变负荷（tumor mutation burden, TMB）和肿瘤新抗原

2.1 TMB TMB定义为肿瘤基因组去除胚系突变后的体细胞突变总数[19,20]。这些基因编码区域的体细胞突变可以诱导新抗原的产生，肿瘤TMB越高，新抗原产生越多，肿瘤免疫原性越高，诱导的T细胞反应越强[21]。因此，高肿瘤TMB与ICIs临床应答存在显著相关性。CheckMate026是一项随机、开放标签的III期临床研究，旨在比较Nivolumab与化疗在PD-L1表达阳性的初治NSCLC患者中的疗效[22]。在PD-L1≥5%的患者中，Nivolumab组与化疗组的PFS和OS无显著差异。探索性分析TMB对临床结局影响时发现，在高TMB患者（≥243 mut/Mb）中，Nivolumab组比化疗组具有更好的ORR（47%vs28%）和更长的PFS（9.7个月vs5.8个月），OS无差异，可能与化疗组内68%的高TMB患者交叉至Nivolumab组相关。CheckMate568是一项单臂II期临床研究，该研究结果表明，晚期NSCLC患者接受Nivolumab联合Ipilimumab双免疫治疗的ORR与TMB呈正相关，TMB≥10 mut/Mb的患者ORR和PFS明显优于TMB<10 mut/Mb的患者（44%vs12%；7.1个月vs2.6个月），且与PD-L1表达水平无关[23]。在此基础上，Checkmate227研究中以TMB≥10 mut/Mb作为高TMB的界值，在PD-L1≥1%的高TMB的晚期NSCLC患者中，Nivolumab联合Ipilimumab双免疫治疗的ORR和PFS均明显优于化疗（45.3%vs26.9%；7.2个月vs5.4个月；HR=0.58，95%CI：0.41-0.81；P<0.001）[24]。在PD-L1<1%的高TMB患者中，也能看到相似结果。但2年OS探索性分析显示接受Nivolumab联合Ipilimumab治疗的患者中，高TMB和低TMB人群OS获益无显著差异[25]。另一项研究[26]表明，接受抗PD-1/PD-L1治疗的NSCLC中，TMB≥20 mut/Mb的患者OS显著延长。Huang等[27]设计了一项回顾性研究，在真实世界中评估TMB与NSCLC患者免疫治疗临床获益的关系，其结果表明，高TMB（≥10 mut/Mb）患者的临床获益明显优于低TMB患者。除了组织中的TMB，血液TMB（blood TMB, bTMB）也被证实具有预测免疫治疗疗效的价值。Gandara等[28]研究表明，在bTMB≥16 mut/Mb的晚期NSCLC患者中，接受Atezolizumab免疫治疗的PFS明显优于多西他赛化疗。MYSTIC研究的探索性分析结果[29]显示，在bTMB≥20 mut/Mb的晚期NSCLC患者中，Durvalumab联合Tremelimumab治疗比化疗具有更长的OS（21.9个月vs10.0个月；HR=0.49，95%CI：0.32-0.74）和更高的12个月PFS率（38.6%vs2.3%）。TMB作为免疫治疗的预测生物标志物，可以帮助筛选出更有可能从免疫治疗获益的人群，但仍然存在一定的不足。TMB在不同临床试验中的临界值不同，TMB检测平台不统一，检测结果的一致性存疑，TMB与ICIs临床疗效并非完全相关，因此TMB和bTMB作为免疫治疗标志物仍需进一步探索。

2.2 肿瘤新抗原 肿瘤新抗原是能被新抗原特异性T细胞受体识别的外来蛋白，因其可以引起T细胞反应，被认为与ICIs应答相关[30,31]。一项回顾性分析[30]表明，高的克隆性新抗原负荷与原发性肺腺癌较长的OS相关，除此之外，高克隆性新抗原负荷与更好的抗PD-1应答相关。Rizvi等[32]研究结果也表明，新抗原负荷高的NSCLC患者具有更好的临床获益。通过预测突变肽和野生肽与主要组织相容性复合体-1（major histocompatibility complex class 1, MHC-1）亲和力间的差异，进而判断肿瘤新抗原的免疫原性，称为差异相似性指数（differential agretopicity index, DAI）[33]。DAI值高表明突变肽与MHC的亲和力高于野生肽，可以诱导产生更多的免疫应答。相较于TMB和传统的新抗原负荷，DAI对于免疫治疗具有更好的预测效能[34]。

3 T细胞炎性基因表达谱（gene expression profile,GEP）

GEP是与抗原呈递、趋化因子表达、细胞毒活性等相关的基因表达谱，可以更加全面地反映肿瘤微环境的免疫状况[35]。GEP与Pembrolizumab疗效间的关系是Keynote-028研究的探索性终点之一，结果表明，高T细胞炎性GEP患者具有更好的临床获益，当TMB联合GEP或PD-L1可以更好地预测免疫获益人群[36]。POPLAR研究[37]的探索性分析显示接受Atezolizumab治疗的患者中，效应T细胞相关基因和IFN-γ相关基因高表达的群体具有更长的OS。

4 基因突变相关标志物

分子靶向治疗是EGFR或ALK敏感突变患者的标准治疗。尽管口服EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）可使患者明显获益，但最终仍因不可耐受的毒副作用或进展停止治疗。既往的试验[38,39]表明，二线单药免疫治疗在EGFR/ALK突变亚组无明显生存获益。Toki等[40]研究表明，EGFR突变样本中PD-L1表达低，即使肿瘤微环境中存在淋巴细胞，大部分也为无活性TIL。EGFR/ALK突变患者还具有较低的TMB。低TMB、PD-L1及CD8+TIL可能是EGFR/ALK突变患者对免疫治疗应答低下的原因[41,42]。IMpower150研究[43]是一项随机、开放标签设计的3期临床试验，在EGFR敏感突变亚组中，与BCP（贝伐珠单抗+卡铂+紫杉醇）相比，Atezolizumab+BCP改善了OS。因此，针对EGFR/ALK突变的NSCLC患者，在分子靶向治疗失败后是否使用免疫治疗，以及免疫治疗与其他治疗方式间如何组合都需要更深的研究。

KRAS是最常见的致癌因子之一，在肺腺癌中，KRAS常与抑癌基因TP53或SKT11发生共突变。KRAS或TP53突变的NSCLC表达更高水平PD-L1，可以从抗PD-1治疗中获益，KRAS/TP53共突变的患者获益更为显著[44]。KRAS基因突变存在多种亚型，各突变亚型与免疫治疗相关性并不一致。癌症基因图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库分析显示，KRASG12D/TP53共突变组PD-L1表达水平和免疫细胞浸润水平明显降低，因此，KRASG12D/TP53共突变可能是肺腺癌患者抗PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂的阴性预测标志物[45]。

SKT11在细胞代谢、细胞生长和调节细胞极性等方面发挥重要作用。SKT11突变与“冷”肿瘤免疫微环境形成相关，SKT11/LKB1突变的肿瘤组织内细胞毒性CD8+T淋巴细胞浸润减少[46]。在接受ICIs治疗的KRAS突变肺腺癌患者中，相较于SKT11野生型，SKT11突变患者PFS和OS更短，动物实验进一步证实SKT11缺失促进PD-1/PD-L1抑制剂耐药[47]。Ricciuti等[48]的研究也表明SKT11突变与KRAS突变肺腺癌患者较差的免疫治疗结果相关。因此，SKT11突变可能是免疫治疗阴性预测标志物。

KEAP1也是一种抑癌基因，既往的研究[49,50]表明KEAP1基因的改变会引起氧化应激通路的失调，从而导肿瘤耐药和放疗抵抗。Chen等[51]分析了泛癌种中KEAP1突变与免疫治疗结局的关系，KEAP1突变患者OS明显缩短，尽管KEAP1突变与高TMB相关，但也引起肿瘤内CD8+T淋巴细胞浸润较少，提示其与“冷”肿瘤免疫微环境的形成相关。另一项真实世界研究[52]也表明KEAP1突变是免疫治疗预后不良标志物。Ricciuti等[48]研究也显示KEAP1突变与KRAS突变的肺腺癌患者较差的免疫治疗结果相关。

DNA损伤应答修复（DNA damage response and repair,DDR）基因在DNA损伤修复过程中发挥重要作用。DDR改变造成基因组稳定性降低，增加肿瘤TMB，增强了肿瘤免疫原性[41]。研究[53]显示，接受免疫治疗的NSCLC中，DDR突变患者具有更好的ORR以及更长的PFS和OS。表明DDR突变预示更好的免疫治疗疗效。

POLE基因编码的DNA聚合酶ε和POLD1基因编码的DNA聚合酶δ1对DNA复制的校正和保真至关重要。POLE和POLD1基因突变可引起DNA损伤修复功能缺陷，造成更多基因突变的发生[54]。一项泛癌种研究[55]发现，POLE/POLD1突变与更高的TMB相关，接受免疫治疗的POLE/POLD1突变患者也具有更长的OS。因此，POLE/POLD1突变是免疫治疗潜在预测生物标志物。

超进展（hyperprogressive disease, HPD）是指患者接受免疫治疗后出现肿瘤加速生长的现象，常伴有生存质量下降和较差的预后。MDM2/MDM4扩增、EGFR扩增、11号染色体上CCND1、FGF3、FGF4、FGF19扩增可以加速肿瘤生长，与HPD的发生存在明显相关性[56,57]。因此，上述基因突变存在的情况下，是否选用免疫治疗需更加谨慎。

5 外周血生物标志物

外周血抽取容易，侵入性低，使得外周血生物标志物极具吸引力。中性粒细胞淋巴细胞比（neutrophiltolymphocyte ratio, NLR）是指中性粒细胞绝对数与淋巴细胞绝对数的比值，在全血细胞计数后即可获取，目前已引起极大的关注。高中性粒细胞浸润但低淋巴细胞浸润的肿瘤微环境可促进血管生成、抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发展。在接受免疫治疗的晚期NSCLC患者中，基线高NLR是一个不良预后因素[58-60]。除了与预后相关外，NLR还可以作为一种预测标志物，对二线使用Nivolumab的NSCLC患者进行回顾性分析发现，NLR升高的患者治疗失败时间更短[61]。因此，NLR可以用于预测免疫治疗反应。除了NLR，血小板淋巴细胞比（platelet-to-lymphocyte ratio, PLR）、相对嗜酸性粒细胞计数（relative eosinophil count, REC）、相对淋巴细胞计数（relative lymphocyte count, RLC）、LDH等都被认为与免疫治疗疗效相关[62]。

可溶性PD-L1（solubale PD-L1, sPD-L1）是PD-L1的一种剪切变异体，其没有跨膜结构域。肿瘤患者血浆中sPD-L1高于健康人。sPD-L1可以诱导免疫抑制，sPD-L1的存在介导PD-L1抑制剂耐药[63]。接受免疫治疗的患者中，高sPD-L1亚组PFS和OS明显比低sPD-L1亚组短，多因素分析提示高sPD-L1是独立的预后不良因素[64,65]。sPD-L1可作为免疫治疗疗效预测和预后的标志。

6 肠道微生物

人体肠道中存在的细菌、病毒、真菌等微生物共同构成了肠道菌群，肠道菌群大多数与人体呈共生关系，与机体相互作用，维持着肠道内的稳态，在机体免疫反应中发挥重要作用[66]。近年来研究表明肠道菌群组成可以影响免疫治疗的疗效。Katayama等[67]研究表明，接受ICI治疗的NSCLC患者肠道内乳酸菌属和梭菌丰度越高，治疗失败时间（time to failure, TTF）越长，对ICI治疗产生应答的患者肠道菌群种类更加多样。Jin等[68]对接受抗PD-1治疗的中国晚期NSCLC患者肠道菌群与临床结局的关系展开研究，结果显示肠道微生物群的多样性与抗PD-1治疗良好反应具有明显相关性，长双歧杆菌、普氏菌和Alistipes putredinis富集的患者具有更长的PFS。Routy等[69]研究显示，免疫治疗前肠道内Akkermansia muciniphila数量多的患者对免疫治疗具有更好的应答，在接受免疫治疗前或治疗期间使用过抗生素的患者PFS明显缩短。小鼠模型中，对ICIs有反应的肿瘤患者的粪便微生物移植到无菌或抗生素治疗的小鼠中，可以改善PD-1抑制剂的抗肿瘤效果。而对ICIs无反应患者的粪便微生物移植则无该效应，口服补充Akkermansia muciniphila使其再定植后，可以恢复PD-1抑制剂的抗肿瘤疗效。肠道菌群的多样性与菌种差异使肺癌患者对免疫治疗具有不同反应，这可能与肠道菌群影响免疫细胞功能、诱导免疫细胞浸润相关。

7 总结

免疫治疗的出现，进一步丰富了肿瘤治疗手段，也开启了晚期NSCLC治疗的新模式。虽然围绕免疫治疗生物标志物进行了许多研究，但仍面临诸多挑战。例如，虽然PD-L1和TMB与免疫治疗疗效存在相关性，但并非所有PD-L1高表达或高TMB患者对免疫治疗应答，而一些PD-L1低表达、不表达或低TMB患者仍能从免疫治疗中获益。单一生物标志物都存在不同程度的不足，会影响免疫治疗获益人群筛选的准确性。因此，通过多种生物标志物联合使用，构建稳定有效的免疫治疗预测模型并寻找更为有效的治疗模式，使接受免疫治疗的患者临床获益最大化，促进肿瘤免疫治疗向精准治疗方向迈进。