中药中木脂素类成分含量测定方法的研究进展

徐 硕,徐文峰,姜文清,邝咏梅,金鹏飞

北京医院药学部,国家老年医学中心,中国医学科学院老年医学研究院,北京市药物临床风险与个体化应用评价重点实验室（北京医院）,北京 100730

木脂素类化合物又称木脂体,该类化合物广泛存在于五味子、陕西瑞香等中药中,多数以游离状态存在,也有些与糖结合成苷存在于植物的木部和树脂中。木脂素类化合物的原始结构骨架是一类由2 个苯丙素单元氧化聚合而成的二聚物,少数也有三聚物和四聚物。该类化合物主要分为简单木脂素类、单环氧木脂素类、木脂素内酯类、环木脂素类、双环氧木脂素类、联苯型木脂素和联苯环辛烯类木脂素等。近年还发现一些结构新颖的木脂素类化合物,包括8-O-4′型新木脂素等[1-2]。木脂素类化合物具有抗病毒[3]、镇静催眠[4]、神经保护[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]和抗糖尿病并发症[7]等多种重要的生物活性。因此,很有必要对中药中木脂素类成分进行含量测定,这对于更好地进行中药质量评价具有重要意义。

1 总木脂素的含量测定

李晓光等[8]通过分光光度法对广东产海风藤药材超临界二氧化碳萃取物中总木脂素含量进行测定。以五味子酯甲为对照品,利用变色酸比色法在570 nm 波长处测定吸光度值A,结果显示,五味子酯甲在21.2～212.0μg范围内线性关系良好,测定6批样品中总木脂素含量为93.1～100.2 mg·g-1。

张颖等[9]采用紫外分光光度法建立了刺五加茎中总木脂素的含量测定方法。样品中加入体积分数为60%的乙醇回流提取,以刺五加苷E为对照品,利用变色酸比色法在560 nm 波长处测定吸光度值A,结果显示,刺五加苷E 在6.93～23.1 μg·mL-1范围内呈良好线性关系,3批样品中总木脂素含量为1.61%～1.63%。

卢曦等[10]以紫外-可见分光光度法测定黑老虎药材中总木脂素的含量。样品中加入甲醇回流提取,以五味子酯甲为对照品,在571 nm 波长处测定吸光度值A。结果显示,五味子酯甲在0.008 16～0.040 8 mg·mL-1范围内线性关系良好,产地为广西防城的药材中总木脂素含量最高。

黄坤等[11]采用紫外分光光度法测定不同产地桃儿七中总木脂素的含量。样品中加入体积分数为70%的甲醇超声提取,以鬼臼毒素为对照品,通过参比波长法在292、392 nm 波长处测定,结果显示,鬼臼毒素质量浓度在7.78～93.36 mg·L-1范围内线性关系良好。测定不同产地共126个桃儿七样品中总木脂素含量,结果表明,以产自甘肃省永登县自然保护区样地的样品含量最高（为20.66%）,产自西藏自治区江达同普乡样地的样品含量最低（为5.46%）。

袁子民等[12]以紫外分光光度法测定肉豆蔻与麸煨肉豆蔻中总木脂素的含量。样品中加入甲醇超声提取,以去氢二异丁香酚为对照品,测定波长为275 nm,结果显示,去氢二异丁香酚质量浓度在1.5～9.0 mg·L-1范围内呈良好线性关系,10批肉豆蔻、麸煨肉豆蔻中总木脂素含量分别为0.913%～1.76%、1.17%～2.21%。

赵金鹿等[13]通过紫外分光光度法测定了哥王中总木脂素的含量。样品中加入体积分数为70%的乙醇回流提取,以罗汉松脂酚为对照品,测定波长为280 nm,总木脂素的质量浓度在10.0～60.0μg·mL-1范围内线性关系良好,测定9批样品中总木脂素含量为5.14～29.78 mg·g-1,产地为广东、江西的药材中总木脂素含量较高,产地为贵州省、广西桂林的含量最低。

杜为军等[14]采用紫外分光光度法测定毛头牛蒡子中总木脂素的含量。样品中加入体积分数为95%的乙醇回流提取,以牛蒡苷为对照品,在280 nm 波长处测定。结果显示,牛蒡苷质量浓度在0.020 7～0.110 1 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

黄莉等[15]采用紫外分光光度法,建立了三白草药材及其抗肝纤维化有效部位中总木脂素含量的方法。样品中加入三氯甲烷超声提取,以三白草酮为对照品,检测波长为244 nm,结果显示,三白草酮质量浓度在1.94～15.52μg·mL-1范围内线性关系良好,三白草药材和有效部位平均回收率分别为99.6%、99.3%,3批三白草及有效部位样品中总木脂素含量分别为1.30%～1.69%、40.7%～52.6%。

李春沁等[16]建立了波棱瓜子药材中总木脂素的含量测定方法。样品中加入石油醚加热回流脱脂,将脱脂后残渣挥干,加入体积分数为95%的乙醇加热回流提取,以木脂素balanophonin为对照品,采用变色酸-硫酸显色体系,在566 nm 波长处测定。结果显示,balanophonin在5.01～17.535μg·mL-1范围内呈良好线性关系,平均加样回收率为98.36%,3批样品中总木脂素含量为2.91%～3.41%。

2 木脂素单体成分的含量测定

2.1 高效液相色谱（HPLC）法

李晓光等[8]对广东海风藤进行超临界二氧化碳萃取,萃取压力为10 MPa,萃取温度为45℃,分离压力为5 MPa,分离温度为50℃。采用Kromasil C18柱,流动相为甲醇-水,梯度洗脱,检测波长为250 nm。结果显示,萃取物中五味子乙素在0.384～2.304μg范围内线性关系良好,6份样品中五味子乙素的含量为24.48～26.32 mg·g-1。

黄坤等[11]对不同产地桃儿七中鬼臼毒素的含量进行测定。样品中加入体积分数为40%的甲醇超声提取,采用Boston Crest ODS C18柱,流动相为甲醇-水（50∶50）,检测波长为290 nm,结果显示,鬼臼毒素质量浓度在0.007 4～0.741 5 g·L-1范围内线性关系良好,测定不同产地共126个桃儿七样品中鬼臼毒素的含量,以产自甘肃省永登县自然保护区样地的样品含量最高（为7.40%）,产自西藏自治区江达同普乡样地的样品含量最低（为0.40%）。

赵玥等[17]测定五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的含量。样品中加入甲醇超声提取,采用Agilent TC-C18柱,流动相为甲醇-乙腈-水,梯度洗脱,检测波长为220 nm。对辽宁凤城地区不同环境五味子样品进行测定,结果表明,生长在山脚树荫丛林中且湿润环境下的五味子中木脂素含量最高,品质较佳。

张萌萌等[18]建立了长形肉豆蔻中赤式-6-澳白木脂素的含量测定方法。样品中加入甲醇超声提取,采用Kromasil C18柱,流动相为乙腈-水（65∶35）,检测波长为228 nm,结果显示,赤式-6-澳白木脂素在0.22～2.24 mg·mL-1范围内线性关系良好,平均加样回收率为100.7%,5批样品中的含量为4.08%～6.80%。

胡俊扬等[19]同时测定五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6个木脂素类成分的含量。样品中加入甲醇超声提取,采用依利特C18色谱柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,检测波长为217 nm,结果显示,6个化学成分分离度良好,各成分质量浓度与峰面积在测定范围内均呈良好的线性关系,不同产地3批样品中6个成分的含量分别为0.62%～0.80%、0.12%～0.33%、0.03～0.07%、0.12%～0.34%、0.37%～0.52%、0.03%～0.13%。

周艳等[20]测定不同炮制品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、戈米辛N、五味子乙素和五味子丙素的含量。样品中加入甲醇超声提取,采用Kromasil-C18柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,检测波长为254 nm,结果显示,6种成分分离度良好,与生品相比,除炮制品中五味子醇乙有提高或降低外,其他5种成分的含量均有不同程度的提高,酒浸法的炮制品中总木脂素含量最高,表明酒浸法为五味子的最佳炮制方法。

阴冠秀等[21]同时测定不同产地五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素和五味子乙素的含量。样品中加入甲醇超声提取,采用Diamonsil C18柱,以甲醇-水（73∶27）为流动相,检测波长为254 nm。结果显示,5种成分的线性范围为0.01～0.08 mg·mL-1,对不同产地的17份药材进行测定,4种木脂素成分均存在一定差异,北五味子中五味子醇甲、五味子醇乙和五味子乙素的含量稍高,五味子甲素含量较低,而南五味子与之相反。

崔妮等[22]以木脂素类成分总含量为指标,对五味子药材中木脂素类成分的提取工艺进行优选。采用Diamonsil C18柱,流动相为甲醇-水,梯度洗脱,检测波长为235 nm,结果显示,五味子中木脂素类成分最佳提取工艺为100倍甲醇超声提取3次,每次1 h,五味子醇甲、gomisin D、gomisin H、五味子醇乙、gomisin G、gomisin B、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素可完全分离,在测定范围内线性关系良好,其中产地为吉林四平的含量最高,为22.94 mg·g-1,产地为黑龙江双城的含量较低,为12 mg·g-1,可能与当地的地理位置和气候有关。

ZHANG Q 等[23]测定了五味子中5 种木脂素的含量。用一种简化的基质分散固相萃取（MSPD）提取样品,对MSPD参数进行了考察和优化,结果显示,最佳的提取条件是以硅胶为分散剂,硅胶与样品的质量比为2∶1,用4 mL 甲醇作为洗脱溶剂,HPLC法定量采用Agilent TC-C18柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱,检测波长为215 nm。MSPD 法对于5种木脂素的提取率高于传统加热回流提取法和超声提取法,减少了对样品、溶剂和时间的要求。测定得5份样品中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素和γ-五味子素的含量分别为2.41～6.55、1.67～2.85、0.82～1.12、0.65～1.46、1.79～3.62 mg·g-1。

杨能英等[24]测定黑老虎中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲和（2′S）-南五味子木脂素J的含量。样品中加入乙醇超声提取,采用ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,流动相为乙腈-甲醇-1 mL·L-1磷酸水溶液,梯度洗脱,检测波长为214 nm。结果显示,日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲和（2′S）-南五味子木脂素J分别在35.56～355.6、32.92～329.2、76.72～767.2 ng范围内线性关系良好。

胡琨等[25]测定八角莲饮片中2种木脂素类成分鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素以及2种黄酮类成分山柰酚和槲皮素的含量。样品中加入体积分数为40%的乙醇回流提取,采用ZORBAX SB-C18柱,流动相为甲醇-1mL·L-1磷酸溶液（50∶50）,将290 nm 作为鬼臼毒素和4′-去甲基鬼臼毒素的定量波长,360 nm 作为槲皮素和山柰酚的定量波长。结果显示,鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚和槲皮素的线性范围分别为0.74～3.68、2.40～12.02、0.21～1.08、0.26～1.28μg,测定12批样品的含量分别为9.46～31.53、0.64～12.08、1.78～2.55、1.10～2.45 mg·g-1。

2.2 超高效液相色谱（UPLC）法

荆文光等[26]建立了同时测定厚朴药材中和厚朴酚、厚朴酚和辣薄荷基厚朴酚含量的方法。样品中加入甲醇冷浸提取,采用Waters Acquity UPLC BEH-Cl8柱,以甲醇-2 mL·L-1甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长为294 nm。结果显示,3种木脂素成分可实现完全分离,并与其他成分分离度良好,和厚朴酚、厚朴酚和辣薄荷基厚朴酚分别在20.3～406.0、15.2～304.0、5.6～112.0 ng范围内与峰面积呈良好线性关系,15批样品中3种成分含量分别为0.24%～2.65%、1.46%～2.68%、0.05%～0.87%。

2.3 液相色谱-质谱联用（LC-MS）法

王金叶等[27]利用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法测定南五味子中3种木脂素的含量。样品中加入乙醇超声提取,采用Eclipse Plus C18柱,流动相为甲醇-10 mmol·L-1乙酸铵,梯度洗脱,电喷雾离子源（ESI）,以多反应监测方式（MRM）进行正离子监测。结果显示,五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素分别在0.61～5 015、531.9～6 058.8、0.64～5 230 ng·mL-1范围内线性关系良好,结果显示,南五味子中五味子甲素含量普遍较高,五味子醇甲与五味子乙素的含量普遍较低,不同产地含量差异较大。

王哲等[28]采用超高效液相色谱-质谱法测定醋五味子中五味子酯甲、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲和五味子醇乙7种木脂素的含量。样品中加入甲醇超声提取,采用Acquity UPLC BEH-Cl8柱,以乙腈-1 mL·L-1甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,质谱分析采用电喷雾正离子源,选择离子监测（SIM）模式。结果显示,7个成分的质量浓度在一定范围内与峰面积线性关系良好,方法的检出限为0.001～0.050 mg·L-1,对质量浓度为6.0 mg·L-1的7种木脂素混合对照品溶液连续测定6次,对4批样品进行测定,五味子醇甲、五味子酚和五味子甲素的含量均较高,不同产地的醋五味子中7种木脂素的含量也不同。

2.4 胶束电动毛细管色谱（MECC）法

TIAN K 等[29]建立了以离子液体为修饰剂的MECC 法测定五味子属药用植物中木脂素类成分。初步研究显示,以十二烷基硫酸钠（SDS）作为表面活性剂不能使待测化合物得到完全分离,在SDS胶束体系中加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（BMIM-BF4）可使待测成分完全分离。考察了BMIM-BF4和SDS浓度、外加电压、背景缓冲液pH 值和浓度等参数对分离的影响,结果显示,最佳测定条件为:背景缓冲液是5 mmol·L-1硼酸盐-5mmol·L-1磷酸盐缓冲液（含20 mmol·L-1SDS和10 mmol·L-1BMIM-BF4）,pH 值为9.2,外加电压为25 kV,检测波长为254 nm,该方法能在＜13 min的时间内成功分离五味子提取物中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素4种木脂素类成分。

2.5 高效薄层色谱（HPTLC）法

MIKROPOULOU E V 等[30]同时测定芝麻中芝麻脂素和芝麻林素2种木脂素类成分的含量。将样品点样于硅胶60 F254高效薄层色谱板,使用自动薄层色谱采样器,点样采用25μL注射器和氮气吸引器,用自动显影室进行显影,标准设置为:滤纸饱和20 min,在相对湿度为33%下进行10 min的显影,用氯化镁作为干燥剂,薄层板干燥5 min。以正戊烷-二乙醚（60∶40）为流动相,在可视化文档系统上记录254、366 nm处的薄层图像。芝麻甲醇提取物点样量为20μL,质控溶液（芝麻脂素和芝麻林素混合物）点样量为5μL,在薄层板上喷洒硫酸香兰素衍生试剂作为显色剂。结果显示,芝麻脂素和芝麻林素的线性良好,检测限和定量限分别低于2、5μg·mL-1,测定18份样品中芝麻脂素和芝麻林素的含量分别为1.13～2.83、0.59～1.48 mg·g-1。

3 结语

中药中总木脂素的含量测定方法主要为紫外-可见分光光度法,木脂素单体成分的含量测定方法包括HPLC 法、UPLC法、LC-MS法、MECC法和HPTLC法,其中HPLC 法以其分离性能高、定量准确、分析速度快及易于推广等优势,在单体成分定量分析中应用较多[31]。对于中药中总木脂素的含量测定也有较多报道,均为采用紫外-可见分光光度法进行定量。木脂素的含量测定研究取得了一定进展,但也存在一些不足之处需要进一步深入探索。在木脂素单体成分测定中,目前报道较多的是以HPLC 法测定药材中的几种含量相对较高的特征性木脂素类成分,缺乏对于其中微量成分的测定。因中药中微量成分也具有药理活性,对其进行定量分析也十分重要,建议可以加强这方面的研究。先通过LC-MS技术对药材中的微量木脂素类成分进行定性分析,之后收集或分离纯化对照品,再对这些成分进行定量,以更好地为中药质量评价提供参考。MECC 法结合了HPLC 法和毛细管电泳的优点,具有高效、高选择性、分析速度快、样品用量少、经济环保等特点,适合于分析复杂组分的样品[32-33]。但该技术用于测定木脂素类成分的报道还较少,可以根据样品情况尝试将MECC法等新技术应用于中药中木脂素类成分的定量分析,将有利于拓宽分析思路和方法。