蒲公英根多糖提取工艺优化研究

刘天娇，王伟男，黄伊慧，靳泽玉，朴 璨，王安琪

（长春人文学院,吉林长春 130117）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.），菊科，蒲公英属，多年生草本植物。其性味为苦、甘、寒，归肝经、胃经，有利尿、缓泻、利胆和退黄疸等功效[1]。蒲公英中的重要组分是多糖类，其含量达到30%～50%，在降血糖、提升免疫力、消炎、延缓衰老、抗病毒和抗癌等方面发挥着重要活性作用[2]。多糖提取是制备饮品的前提，根据相关文献得知多糖提取的方法有很多，如水醇法、酶消化法、超声波萃取法、超滤法、离子交换技术、酸提法和凝胶柱层析法等[3]。国内对多糖提取有丰富的经验，宋晓勇等[4]采用超声波辅助提取法提取蒲公英中的多糖成分。张静等[5]通过水提醇沉法提取蒲公英根的多糖成分。通过对比相关文献，从多糖的提取率、所用时间、温度、提取次数及操作者的能力等多方面考虑，本研究选择热水浸提法。但多糖在提取过程中通常含有非必需物质，重要的非必需物质包括蛋白质和色素，不仅影响多糖的活性作用，也是后期多糖分离纯化和结构检测的一大难题。因此，研究一种脱色和脱蛋白效果较优的工艺至关重要。本研究以蒲公英根为目标，以脱色率、脱蛋白率和多糖损失率为参考数据，以过氧化氢和壳聚糖两种脱色方法以及Sevag法和盐析法两种脱蛋白方法的作用结果进行对比，探索最有利的蒲公英根多糖初步纯化工艺试验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蒲公英根、石油精、乙醇、无水酒精、硫酸、丙酮、氯仿-正丁醇、氯化钙和过氧化氢。

1.2 蒲公英根多糖的提取方法

1.2.1 蒲公英根多糖的初步提取

清洗蒲公英根，晾干，用破碎机磨成细末，过5号筛备用。用滤纸包好蒲公英粉末，放入索式提取器，将石油醚倒入索氏提取器中且没过滤纸包静置浸泡1.5 h，再用80 ℃的石油精回流脱脂1.5 h。风干脱脂后的滤纸包，用80 ℃的调温电加热套使90%乙醇回流1.5 h，以除去样品中的单糖、寡糖以及其他物质。各取1 g吹干回流后的滤纸包粉末，进行单因素及正交试验。热水浸提后的溶液用分光光度计测量。波长设置为492 nm，分光光度计测量时用蒸馏水作对照，使用方法为苯酚-浓硫酸法。打开旋转蒸发仪按钮，调整转速，待蒸馏瓶内有提取液液滴均匀落下时，旋蒸开始，对提取液进行浓缩。

1.2.2 脱色及脱蛋白

（1）过氧化氢的脱色。将称取后的蒲公英根多糖放进蒸馏水中溶解，按正交试验方案进行脱色。

（2）壳聚糖的脱色。将称取后的蒲公英根多糖放入蒸馏水中溶解，按照正交试验方案加入不同体积的壳聚糖，搅拌、静置、离心。

（3）盐析法。取适量脱色后的蒲公英根多糖溶液，调节pH值，加入氯化钙粉末至溶液等电点，搅拌、冷却、离心，去沉淀，取上清液。

（4）Sevag法。取6份适量脱色蒲公英根粗多糖溶液，脱蛋白6～8次。加入每份多糖溶液1/4体积的Sevag试剂，振荡、离心，取上层溶液。①醇析：脱蛋白，脱色后，将95%乙醇加入提取液中，4 000 r·min-1离心5 min，沉淀即为粗多糖。②纯化：粗多糖在水中重新溶解，透析40 h，95%乙醇沉淀，放入离心机中，设定4 000 r·min-1离心10 min，无水乙醇沉淀、丙酮洗涤3次，干燥，得到精制多糖。

1.3 葡萄糖标准曲线的建立

用可见分光光度计在492 nm处测量不同浓度的葡萄糖标准溶液的吸光度，以葡萄糖标准液的浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标绘制标准曲线[6]。

1.4 蒲公英根多糖的单因素及正交试验

1.4.1 单因素试验

分别以温度60 ℃、70 ℃、80 ℃，料液比1∶15、1∶ 20、1∶ 25（g∶mL），时间 1.5 h、2.0 h、2.5 h做3因素3水平单因素试验。

1.4.2 正交试验

根据单因素试验改进的结果，选取温度（A）、料液比（B）、提取时间（C）3个因素按L9(33)设计正交实验。因素设计水平见表1。

表1 蒲公英根多糖提取因素与设计表

1.5 蒲公英根多糖脱色与脱蛋白方法比较

1.5.1 蒲公英根多糖脱色对比

蒲公英根多糖脱色工艺流程：粗多糖→称重→复溶→加入脱色剂→脱色→测定吸光度和多糖含量。在此工艺流程的基础上进行过氧化氢法与壳聚糖法比较。

1.5.2 蒲公英根多糖脱蛋白对比结果

蒲公英根多糖的脱蛋白方法步骤。①Sevag法。向提取液中加入氯仿-正丁醇，离心，取上清液。②盐析法。加入氯化钙粉末，搅拌，冷却，离心，取上清液。按照步骤将Sevag脱蛋白方法与盐析脱蛋白法进行对比。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

吸取葡萄糖标准液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL，分别置于10 mL试管中，编号1、2、3、4、5和6，各加入蒸馏水至1.0 mL，加入苯酚溶液1 mL，摇匀，再快速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀后放置5 min，在95 ℃水浴锅中加热约15 min，取出后冷却至室温。以1号试管为对照组，用分光光度计测量492 nm处的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 蒲公英根多糖提取的单因素试验结果分析

2.2.1 温度对蒲公英根多糖得率的影响

在固液比1∶20和提取时间为1 h的条件下，在不同温度（60 ℃、70 ℃、80 ℃）下提取1 g样品。按标准曲线法吸取0.5 mL样品稀释液进行操作，实验结果如图2所示。

图2 温度对蒲公英根多糖提取的影响

由图2可知，蒲公英多糖含量在60～70℃时逐渐上升，超过70 ℃时逐渐下降，根据实际情况，蒲公英多糖提取温度以70 ℃为宜。

2.2.2 料液比对蒲公英根多糖得率的影响

在温度70 ℃、提取时间1 h条件下，称取1 g样品，分别以1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）的浸提液进行提取，吸取样品溶液0.5 mL，按标准曲线法进行操作，结果如图3所示。

图3 料液比对蒲公英根多糖提取的影响

由图3可知，蒲公英多糖料液比在1∶15～1∶20时多糖含量上升，但后半段曲线上升速度降低，根据试验结果，料液比以1∶25为宜。

2.2.3 提取时间对蒲公英根多糖得率的影响

取1 g样品在提取温度70 ℃、液料比1∶20的条件下，选择提取时间分别为1.5 h、2.0 h、2.5 h进行提取吸取滤液，吸取样品稀释液0.5 mL按标准曲线方法操作，实验结果如图4所示。

图4 提取时间对蒲公英根多糖提取的影响

由图4可知，提取时间越长，蒲公英根中多糖含量越高，蒲公英多糖提取时间以2.5 h为宜。

2.3 蒲公英根多糖提取的正交试验结果及分析

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化提取工艺。以蒲公英根多糖的得率为指标。正交试验结果见表2。

由表2中的极差R可知，温度对蒲公英根多糖得率影响较大，其次是提取时间，而料液比对蒲公英根多糖得率影响最小。考虑到生产成本，确定其最佳组合，即提取温度70 ℃，料液比1∶25，提取时间180 min，得到的蒲公英根多糖得率较高。

表2 正交试验结果

2.4 蒲公英根多糖脱色与脱蛋白方法比较

2.4.1 蒲公英根多糖脱色对比结果

由表3可知，采用过氧化氢法与壳聚糖法时，随着测试次数的增加，脱色率逐渐增加，多糖损失率也逐渐增加。经过对比，选取壳聚糖法脱色时选择脱色次数为8次最佳，此时脱色率为85.37%，多糖损失率为17.60%。因此本实验采用壳聚糖对蒲公英根多糖进行脱色。壳聚糖脱色不仅能有效去除多糖中的色素，还能很好地保护多糖的生物学特性，可作为一种新型的多糖脱色剂。

表3 过氧化氢法与壳聚糖法脱色方法对比结果表

2.4.2 蒲公英根多糖脱蛋白对比结果

由表4可知，采用Sevag法与盐析法脱蛋白时，蛋白质去除率和多糖损失率随实验次数的增加而增加。经过对比，选取盐析法脱蛋白时选择脱蛋白次数为8次最佳，此时蛋白脱除率为86.43%，多糖损失率为18.52%。全面考虑脱蛋白率、多糖损失率等因素，采用盐析法对蒲公英根粗多糖溶液进行脱蛋白，初步纯化蒲公英根粗多糖。

表4 Sevag法与盐析法脱蛋白方法对比结果

3 结论

通过单因素及正交试验，得出以下结论：温度是热水浸提蒲公英根多糖最主要的因素，其次是提取时间，最后是料液比，最佳提取工艺为提取温度70 ℃， 料 液 比 1∶25， 提 取 时 间180 min；采用壳聚糖对蒲公英根多糖进行脱色可达到很好的效果；全面考虑脱蛋白率、多糖损失率等因素，本文采用盐析法对蒲公英根粗多糖溶液进行脱蛋白，在此条件下，蒲公英根多糖得率较高。