HPLC-ELSD法检测食品中的β-环状糊精

钟紫彤

（佛山市质量计量监督检测中心，广东佛山 528225）

环状糊精（β-cyclodextrin）是淀粉经酸解环化生成的产物。β-环状糊精具有包裹各种化合物分子的能力，可以改变被包裹物质的物理和化学性质，提高被包裹物对光、热和氧的稳定性。作为一种多功能食品添加剂，β-环状糊精具有选择性高、无毒、可食用、不吸湿、化学稳定性好及易分离等优点[1]。β-环状糊精在《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2011）中属于各类食品中按生产需要适量使用的食品添加剂[2]。而在现今实行的《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中，规定了β-环状糊精在胶基糖果、方便米面制品、预制肉制品、熟肉制品、碳酸饮料以及风味饮料等食品中的最大使用量[3]。关于食品用香料新品种2-乙酰氧基-3-丁酮、食品添加剂β-环状糊精等4种扩大使用范围的公告2017年第10号[4]和《关于弯曲乳杆菌等24种“三新食品”的公告》（2019年第2号）[5]使其适用范围继续扩大。从国际上看，国际食品法典委员会、欧盟委员会、日本厚生劳动省等均允许β-环状糊精作为食品添加剂用于食品。根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员对β-环状糊精的评估结果，该物质的每日允许最大摄入量为5mg·（kg bw）-1。说明国家在规定β-环状糊精的使用范围和最大使用量的过程中是谨慎且与国际接轨的，但是与此相对的是食品中的β-环状糊精并没有对应的官方检测方法。因此，建立能准确检测食品中β-环状糊精的方法，对食品添加剂风险监测、产品质量分类以及食品生产方质量控制都具有重要的意义。

β-环状糊精含有大量羟基基团，溶于水，但由于无紫外吸收，也无荧光吸收，在常规的高效液相色谱紫外检测器或者荧光检测器中均无明显响应，故无法使用这两种检测器进行检测。高效液相色谱串联示差折光检测器法（Refractive Index Detection，RID）为目前较为常见的检测方法[6]。因为RID是通过测量液相色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的，液体的折射率和基线平衡受温度变化影响较大[7]。而根据光散射原理进行检测的高效液相色谱法串联蒸发光散射检测器法（Evaporative Light Scattering Detection，ELSD），因为其不依赖于待测物如紫外吸收、荧光吸收等化学结构特点以及相对高的灵敏度，被广泛地应用于食品检测。一般而言，ELSD比RID灵敏度更高，检出限更低，线性范围更广。因此，本研究拟以简便易用为宗旨，开发出新的、灵敏的β-环状糊精检测方法，通过在方便米饭、调味牛肉片及可乐型饮料基质影响下，验证方法的线性范围、检出限、精密度和回收率，为今后检测方法的发展和更新提供一定的数据基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用样品为市售方便米饭、调味牛肉片及可乐型饮料。

1.2 试剂与仪器

标准物质：β-环状糊精（纯度96.7%），曼哈格生物科技（北京）有限公司；甲醇（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；0.45 μm有机滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；氮气（纯度99.999 5%），液化空气（广东）工业气体有限公司；实验室用水为超纯水，重庆摩尔水处理设备有限公司。

1260高效液相色谱仪配1260InfinityELSD蒸发光散射检测器，美国安捷伦公司；Secura224-1CN电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制

将β-环状糊精标准品在101～105 ℃充分干燥2 h后，准确称取标准品2.068 3 g，在100 mL容量瓶中用水定容至刻度，配制成20 mg·mL-1的β-环状糊精标准储备溶液。分别吸取适量的β-环状糊精标准液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成质量浓度分别为 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和 2.0 mg·mL-1的工作液。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：InfinityLab ZORBAX Eclipse Plus C18柱（21.2 mm×250 mm，5 μm）；流动相：10%甲醇+90%水（体积比）；等度洗脱；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；蒸发光散射检测器的漂移管温度：90 ℃；雾化器温度：80 ℃；载气流量：1.60 SLM。

1.3.3 样品前处理

方便米饭、调味牛肉片用研磨机充分粉碎并搅拌均匀；可乐型饮料取多个预包装样品直接混合，称取20～40 g（精确至0.001 g），放入100 mL烧杯中置于超声波清洗器中超声30 min，驱除二氧化碳。

准确称取约2 （g精确至0.001 g）样品于25mL具塞离心管中，加约10 mL水，涡旋混匀，于50 ℃水浴超声20 min后取出冷却至室温，加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）和乙酸锌（183 g·L-1）溶液各 1 mL，充分摇匀后于6 000 r·min-1离心10 min，将上层水相转移至25 mL容量瓶中，加水10 mL到剩余残渣中，涡旋混匀后超声5 min，于6 000 r·min-1离心10 min，水相合并到同一25 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取适量上清液过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

2 结果与分析

2.1 标准溶液色谱图

β-环状糊精在1.3.2色谱条件下有较强响应，定性重复性（RSD为0.27%，n=5）良好，标准色谱图如图1所示。

图1 β-环状糊精在不同浓度下的色谱图

2.2 标准曲线

用β-环状糊精标准储备溶液制备一系列不同浓度的标准溶液，按照1.3.2色谱条件，进样体积为10 μL，绘制以含量为横坐标，峰面积为纵坐标的标准曲线。如图2所示，在0.1～2.0 mg·mL-1具有良好的线性关系（y=1 388.518 57×x1.76244，r=0.999 69）。

图2 β-环状糊精标准曲线

2.3 检出限

于方便米饭、调味牛肉片及可乐型饮料3种空白基质中均添加1.0 g·kg-1β-环状糊精，按照1.3.3方法进行处理，样液用液相色谱测定6次，记录信噪比。3种基质影响下测定的信噪比（S/N）均大于3，其中方便米饭信噪比均值为8.67；调味牛肉片信噪比均值为3.23；可乐型饮料信噪比均值为7.50。

2.4 重现性实验

取方便米饭、调味牛肉片及可乐型饮料3种样品，按1.3.3方法处理，按1.3.2色谱条件供液相色谱测定，在重复性条件下各获得5次独立测定结果，以检验测试样品重现性。由表1可知，3种样品的相对标准偏差为0.22%～1.01%，该方法重现性良好。

表1 β-环状糊精方法重现性结果

2.5 加标回收率

分别在方便米饭、调味牛肉片及可乐型饮料3种样品中各加入 400 μL、1.0 mL、2.0 mL β- 环状糊精（5.0 mg·mL-1）标准溶液（理论加标量为 2.0 mg、5.0 mg、10.0 mg），按照1.3.3方法制备加标回收样品溶液，同时做样品空白，在1.3.2色谱条件下进行测定，计算平均测得值及回收率。由表2可知，3种样品在3种浓度水平的平均加标回收率为87.0%～99.4%，该方法的回收率较为理想。

表2 β-环状糊精加标回收率测定结果

3 结论

本文建立了HPLC-ELSD法测定食品中β-环状糊精含量的方法。样品用水提取后经蛋白沉淀剂沉淀蛋白，使用C18柱分离，以甲醇∶水（10∶90）为流动相等度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，ELSD检测器检测，外标法定量。方法的检出限为1.0 g·kg-1，精密度为0.22%～1.01%，和回收率为87.0%～99.4%，线性关系良好，r=0.999 69。该方法准确、可靠，适用于食品中β-环状糊精含量的测定。