婴儿配方食品中生物素含量的测定

江蓝蓝，刘 庆，钟俊威

（广州质量监督检测研究院，广东广州 510110）

生物素（Biotin）又称维生素 H，属于水溶性 B族维生素。生物素可能有8种同分异构体，其中只有D-生物素是天然存在的，具有维生素的功能[1]。生物素是蛋白质、脂肪代谢的必需物质[2]。食品安全国家标准 GB 10765—2010[3]明确规定了婴儿配方食品中生物素的添加量为0.36～2.39 μg/100 kJ。

目前，现有生物素的测定方法主要有液相色谱法[4]和微生物法[5]、液相色谱-质谱联用法[6-7]、酶联免疫法[8]、荧光免疫层析法[9]和生物传感器法[10]等。其中，微生物法是GB 5009.259—2016[5]所采用的方法，灵敏度较高，适用于添加量较低的基质样品，但该方法存在检测周期长，需要无菌操作等问题。酶联免疫法虽然有较强的专一性，但是试剂盒价格较贵，不适用于日常检测；生物传感器法存在重现性不好的问题；生物素无典型的荧光发色团和紫外发色团，导致分光光度法和适用紫外检测器的高效液相色谱法都存在灵敏度低的问题，也导致了荧光法的可靠性存在缺陷。

婴儿配方食品具有基质复杂，生物素含量添加量低的特点。本研究拟建立一种用PLS固相萃取小柱净化，经反向C18柱分离，UPLC-MS检测，内标法定量的分析方法，为婴幼儿配方乳粉中生物素的检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

D-生物素（纯度≥99.0%）；生物素-d4内标（纯度≥98%）；甲酸；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；二氯甲烷（色谱纯）；高氯酸（优级纯）；PLS固相萃取小柱；0.22 μm水相滤膜。

1.2 仪器和设备

AB 4500型液相色谱-串联三重四极杆质谱仪；分析天平（感量为0.1 mg和0.01 mg）；恒温水浴锅；超声波发生器；涡旋混合器；离心机。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）生物素标准储备液（100 μg·mL-1）配制。准确称取0.01 g（精确到0.1 mg）生物素标准品（浓度97.8%），用50%乙醇溶液定容至100 mL。在4 ℃避光保存，有效期为12个月。

（2）生物素 -d4 内标储备液（10 μg·mL-1）配制。准确称取0.5 mg（精确到0.01 mg）生物素d4内标标准品（＞95%），用50%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，于4 ℃避光保存，有效期为12个月。

（3）生物素标准中间液（0.5 μg·mL-1）配制。准确吸取5 mL生物素标准储备液，用水稀释并定容至100 mL，配制成浓度为0.5 μg·mL-1的生物素标准中间液，现配现用。

高碳天然气捕集技术：以松南高碳天然气分离捕集装置为代表，采用MDEA胺法脱碳工艺，将松南高碳气田（二氧化碳含量23%）中的二氧化碳捕集分离，生产清洁天然气，年处理能力达50万吨。

（4）生物素 -d4 内标中间液（1.0 μg·mL-1）配制。准确吸取1 mL生物素-d4内标储备液用水稀释并定容至10 mL，配制成浓度为1.0 μg·mL-1的标准中间液，现配现用。

（5）生物素标准工作液配制。将生物素标准中间液逐级稀释得到浓度为 5.00 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1、80.0 ng·mL-1和 100 ng·mL-1的标准工作液，每个浓度的标准中间液中加入100 μL 生物素 -d4 内标中间液（1.0 μg·mL-1），用水定容至1 000 μL，现配现用。

1.3.2 样品处理方法

（1）提取。称取0.5～2.0 g（精确到0.000 1 g）样品于50 mL离心管中，加0.775 mL内标中间液，加14.225 mL 50 ℃左右的超纯水溶解，混匀，振荡5min，加入0.5 mL 60%的高氯酸溶液和5 mL二氯甲烷，振 荡 5 min，6 000 r·min-1离 心 5 min， 取 出 上 清液。向下层残留物加入15 mL 50 ℃左右的超纯水和0.5 mL 60%的高氯酸溶液，再按上述步骤重复提取一次，合并两次提取的上清液，待净化。

（2）样品净化。依次加入6 mL甲醇，6 mL水活化PLS固相萃取小柱小柱，将4 mL上清液加入固相萃取柱中，用6 mL水淋洗，以上流出液都弃去。用6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在40 ℃下氮吹至近干，用1.00 mL水复溶，振荡混匀，用0.22 μm水相滤膜过滤后上液相质谱仪分析检测。

1.3.3 色谱及质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（1.8 µm，2.1 mm×100 mm）；流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：100%乙腈；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL。

（2）质谱条件。电离模式：ESI+；离子化电压：+5 500 kV；温度：350 ℃；监测方式：多离子反应监测（MRM）。质谱参数详见表1。

表1 主要质谱参数

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

实验比较乙腈-10 mmol·L-1甲酸铵（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸与乙腈-10 mmol·L-1甲酸铵对目标物峰形、分离效果以及灵敏度的影响。结果表明，乙腈-10 mmol·L-1甲酸铵（含0.1%甲酸）的分离效果不好，响应值也较低；乙腈-10 mmol·L-1甲酸铵的保留最差。乙腈-0.1%甲酸的分离效果较好，响应高，故采用乙腈-0.1%甲酸作为流动相。

2.1.2 确定质谱条件

通过电喷雾电离源正离子扫描模式，调谐并优化锥孔的碰撞能量以及电压等参数，确定了定性定量离子对为D-生物素和生物素-d4，具体质谱参数见表 1。在最优的色谱-质谱条件之下，生物素及内标标准溶液（100 ng·mL-1）的 MRM 色谱图见图1。

图1 生物素及生物素-d4内标标准溶液MRM色谱图

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线及检出限、定量限

以生物素浓度为横坐标，以生物素与生物素内标峰面积比（A生物素/A生物素-d4）为纵坐标，绘制生物素的校准曲线。在5～100 ng·mL-1线性符合要求，线性回归方程为y=0.012x+0.006 67，线性相关系数为0.999 9。检出限为0.3 μg/100 g，定量限为1.0 μg/100 g，可适用于婴幼儿配方乳粉中生物素的定性定量分析。

2.2.2 方法的重现性

选取市售某品牌婴儿配方食品（1段奶粉）为代表考察方法的重现性，每个样品测试6个平行样品，精密度为1.49%，实验数据稳定，方法重现性好。测试结果见表2。

表2 方法精密度结果

2.2.3 方法准确度

选取市售某品牌婴儿配方食品（1段奶粉）为代表进行回收率实验，向样品中分别加入低、中、高3个加标浓度水平，每个浓度取6个平行样，结果见表3。加标回收率在96.5%～98.8%，相对标准偏差在1.77%～2.56%，该方法对不同浓度的生物素的测定具有较高的准确度。

表3 方法回收率和精密度结果

2.2.4 与国标方法对比

应用本方法和GB 5009.259—2016方法对市售6个不同品牌的婴儿配方乳粉进行生物素含量测定，两种测试方法的结果并没有明显的差异，故此实验所建立的方法可适用于婴儿配方乳粉，结果见表4。

表4 本方法与国标方法（GB 5009.259—2016）生物素含量测试结果比较

3 结论

针对婴儿配方食品形态多样化、复杂化的特点，本实验采用PSL固相萃取小柱对其进行净化，从而降低基质干扰成分的影响；而定量分析则使用了同位素内标法来降低质量效应和前处理过程引起的偏差，从而使分析方法的准确性和稳定性得到了提高。

本文建立的方法通过使用HPLC-MSIMS法进行测定，有效提高了分析效率，缩短了检测周期。通过实验对比，证实本方法与国家标准中采用的微生物法的测定结果无显著差异，可将此方法用于婴幼儿配方食品中生物素的分析检测。同时本方法还具备操作简单，灵敏度更高，检测周期更短，重现性好的特点，可以为婴儿配方食品的产品质量控制和监督提供强有力的技术支持，也为婴儿配方食品中生物素的测定提供科学依据。