TGF-β在增殖性视网膜疾病中的研究进展

黎晓冬，李志林，武海燕，何润西，罗雪妮，谢学军

0引言

转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是具有调控细胞增殖、凋亡及分化等多种作用的细胞因子，其介导的经典和非经典信号通路通过调节肌成纤维细胞转化与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)重塑参与各种人体组织的纤维化进程。其中TGF-β介导的病理性纤维化可破坏正常的视网膜神经组织，诱发纤维血管瘢痕增生和继发性视网膜脱落，导致不可逆的视力丧失，这可能与增殖性视网膜疾病的发病机制关系密切，故本文主要对TGF-β在增殖性视网膜疾病中的作用机制及未来治疗前景作简要阐述。

1 TGF-β简述

TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白、生长分化因子等30多个成员，TGF-β是TGF-β家族蛋白中研究最多的多功能肽生长分化因子，在哺乳动物中已发现在氨基酸水平上有70%～82%同源性的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型，其在控制细胞生长发育、增殖、分化、凋亡，组织修复，血管生成及炎症等过程中发挥着关键作用[1-2]，TGF-β失调可介导多种病理过程，导致组织纤维化、慢性炎症、免疫抑制等[3-4]。TGF-β最初以无活性的同型二聚体形式存在，经mRNA翻译后，无活性的TGF-β前体被加工并分泌到ECM中，与TGF-β结合蛋白(TGF-β binding protein，LTBP)和潜伏期相关蛋白(latent protein，LAP)形成TGF-β/LAP/LTBP复合物保持无活性状态[5]，随后被纤溶酶、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及血小板反应蛋白等多种蛋白酶激活释放出活化的TGF-β，与细胞膜上的TGF-β受体2(TGF-β receptor 2，TGFR2)相结合，此时涉及经Smads介导的经典信号通路和非Smads介导的其它信号通路，经典信号通路通过TGFR2募集并激活TGFR1后以激活Smad2和Smad3信号，再与Smad4结合生成Smads复合体易位至细胞核与DNA结合转录因子和辅因子相互作用以激活或抑制靶基因表达[6]；非Smads介导的信号通路包括PI3K/Akt/mTOR信号通路、细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun terminal kinase，JNK)通路及Rho样GTPase信号通路。多数TGF-β受体位于细胞内，研究表明TGF-β诱导的低水平细胞表面TGF-β受体激活时，可以迅速将细胞内的TGF-β受体转移到细胞表面，从而增加细胞表面TGF-β受体的丰度和细胞对TGF-β信号的反应[7]。

2眼内的TGF-β

TGF-β三种亚型在眼内房水及玻璃体液中均能检测到，目前尚未检测到活性的TGF-β1，且玻璃体内87%的TGF-β以无活性形式存在。TGF-β2是房水和玻璃体液中的主要亚型，研究显示房水中TGF-β2∶TGF-β3∶TGF-β1三种具有活性的亚型的比率为1∶0.4∶0[8]，此外，通过免疫荧光定位的方法显示TGF-β三种亚型在眼前节及眼后段组织细胞中分布不均匀，见表1。

表1 眼部TGF-β三种亚型分布情况

3 TGF-β与纤维化

纤维化过程通常持续数月至数年，涉及到生长因子，炎症介质和ECM组分之间的动态相互作用，可以影响全身任何器官，且有数据表明因器官衰竭导致的死亡率高达45%[9]。纤维化可以定义为组织正常结构成分破坏时，细胞通过上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)为肌成纤维细胞，产生大量炎症介质及异常的ECM蛋白(包括胶原蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白和肌腱蛋白)，过量异常ECM蛋白不仅导致分泌的ECM积累过多，还能间接重塑ECM，导致瘢痕和无功能组织的形成[10]。因此肌成纤维细胞转化与ECM积累是纤维化过程的主要影响因素。目前研究证实TGF-β信号通路在肌成纤维细胞转化过程中起主要作用，通过激活经典信号通路中Smad3直接与基因启动子结合诱导促纤维化分子的转录，诱发肌成纤维细胞活化和ECM沉积[11]；也有研究表明TGF-β可以直接通过上调ECM蛋白的表达调节ECM积累[12]。病理性瘢痕真皮成纤维细胞分泌高水平的TGF-β，通过激活素样激酶 5(activin-like kinase 5，ALK5)发出纤维化基因转录的信号。既往研究在伤口愈合的体外模型中发现了ALK5的小分子抑制剂—galunisertib，该研究用外源性TGF-β诱导人真皮成纤维细胞纤维化，体外划痕实验显示，galunisertib能显著增强细胞迁移和体外伤口闭合，且基因表达分析显示纤维化基因表达显著减弱，抗纤维化基因表达增加，蛋白质合成测定证实了药物活性及转录结果。这表明galunisertib可对真皮成纤维细胞发挥抗纤维化作用，同时提高体外伤口闭合率[13]。

4 TGF-β与增殖性视网膜疾病

TGF-β信号通路介导纤维化过程破坏正常的视网膜神经组织，诱发纤维血管瘢痕增生和继发性视网膜脱落，导致不可逆的视力丧失。与纤维化相关的增殖性视网膜疾病主要为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitroretinopathy，PVR)、新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular age-related macular degeneration，nARMD)和增殖期糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)等纤维血管膜形成相关的疾病[14]。

4.1TGF-β与PVR PVR是经手术修复视网膜脱离后的一种严重并发症，其发病特点是视网膜表面形成无血管的纤维细胞性增殖膜。这些继发性视网膜前膜的形成与收缩导致视网膜结构改变，致视网膜褶皱、撕裂甚至牵引性视网膜脱离[15]；研究表明，PVR继发的纤维膜主要由RPE细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞和巨噬细胞等异质细胞群和过量的ECM组成，成纤维细胞和肌成纤维细胞被认为是纤维膜内的主要收缩细胞表型。在EMT期间细胞间黏附和顶面-底侧细胞极性的缺失使得RPE细胞表型发生改变，TGF-β诱导RPE细胞为成纤维细胞与肌成纤维细胞，促进细胞增殖、迁移和过量的ECM生成参与纤维膜的形成，并在应力纤维中表达α-平滑肌肌动蛋白，增加纤维膜收缩性，导致牵引性视网膜脱离，上述过程在PVR的发病机制中起关键作用[16]。此外，多项研究证明TGF-β/Smad经典信号通路在RPE细胞EMT过程的重要性；Saika等[17]通过特定视网膜下纤维化的小鼠模型发现阻断TGF-β/Smad信号通路下游的关键蛋白Smad3，可以抑制RPE细胞的EMT过程从而阻止PVR的进展。Choi等[18]利用人RPE细胞系ARPE-19模型研究发现，抗纤维化药物吡非尼酮可明显抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞样表型，且呈剂量依赖性，其通过阻止活性Smad2/3复合物的核转位抑制TGF-β信号通路。此外，国内学者发现甲基CpG结合蛋白2(methyl CpG binding protein，MeCP2)的下调也可以抑制TGF-β诱导的Smad2/3激活和Ⅰ型胶原和纤连蛋白的表达，通过染色质免疫沉淀法发现MeCP2与TGF-β结合，且P-MeCP2-421在PVR膜中高表达，提示MeCP2特别是P-MeCP2-421可能在PVR发病机制中发挥重要作用，靶向MeCP2可能是PVR的一种潜在治疗方法[19]。另有研究显示，PVR患者玻璃体液中TGF-β1表达明显增高，但其表达量与PVR临床严重程度分级无直接关系，可能在其病程的初始阶段具有更大的相关性[20]。

同时，TGF-β非经典信号通路在调节RPE细胞的EMT过程中也起重要作用，如TGF-β2通过激活p38 MAPK、ERK1/2和Jagged/Notch信号抑制人RPE细胞中EMT过程[21]，且TGF-β2诱导的PI3K/Akt信号途径的激活有助于RPE细胞中Ⅰ型胶原的表达与合成[22]。此外，在PVR患者的玻璃体和增殖纤维膜中检测到TGF-β水平上调，尤其是TGF-β2及其受体表达水平上调与PVR严重程度呈正相关[23]。Trichostatin A是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，已被证明可同时抑制经典TGF-β/Smad信号通路和非经典通路，并通过阻止α-平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白、Ⅰ型和Ⅳ型胶原蛋白、转录因子Snail及Slug的表达上调抑制TGF-β诱导的RPE细胞EMT过程[24]；有研究在PVR小鼠模型和体外人ARPE-19细胞实验中发现Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)的激活与TGF-β2信号通路密切相关，YAP还是PVR中EMT和纤维化反应的重要调节因子，抑制YAP可能是PVR治疗干预的潜在靶点[25]。此外，一项动物实验表明活化的凝血因子X(activated blood coagulation factor X，FXa)可以通过促进RPE的EMT过程加剧外伤性PVR的发展[26]。上述研究提示对于防治PVR的新药研发前景十分可观。

4.2TGF-β与nARMD 年龄相关性黄斑变性(ARMD)是一类涉及黄斑深层和周围脉管系统的病理改变，从而导致中心视力丧失的致盲性眼底疾病，是60岁以上人群不可逆失明的原因，影响全球近2亿人。根据病理特征主要分为干性ARMD和nARMD，以黄斑周围玻璃膜疣为特征的干性ARMD约占所有患者的80%～85%，通常具有更好的视力预后；其余15%～20%的患者为nARMD，黄斑处脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)导致视网膜出血和渗出，视力下降严重，治疗不及时最终导致视网膜下纤维化、瘢痕化及永久性视力丧失，约占因ARMD导致视觉功能严重下降患者的80%[27]。视网膜下纤维化是CNV之后的伤口愈合反应，其特征是TGF-β等生长因子及炎性因子可以诱导RPE细胞发生EMT，导致过量ECM的实质性重塑[28]。体外实验发现，在ARPE-19细胞中，TGF-β诱导EMT的经典介质即转录因子Snail的表达，Snail可促进血管内皮钙黏蛋白和紧密连接蛋白的表达减少，介导纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的表达增加，从而诱导细胞的迁移活性，TGF-β2促进ARPE-19细胞通过介导尿激酶型纤溶酶原激活物的表达侵入胶原凝胶，诱导过量Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的合成与表达[29]，这两种ECM蛋白参与视网膜下纤维化破坏视网膜功能和神经元变性[30]。Moon等[31]发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米可有效抑制RPE细胞的增殖、迁移及阻断TGF-β1信号通路介导的RPE细胞EMT；维甲酸受体-γ激动剂也可以抑制RPE细胞的EMT，延缓TGF-β介导的视网膜下纤维化反应[32]。另有研究发现肾上腺髓质素(adrenomedullin，AM)及其受体活性修饰蛋白2(receptor activity-modifying proteins，RAMP2)敲除的小鼠模型表现出新生血管形成、视网膜下纤维化和巨噬细胞侵袭，使用TGF-β抑制剂后AM-RAMP2敲除小鼠视网膜下纤维化明显改善，表明AM-RAMP2是通过阻断RPE细胞EMT抑制视网膜下纤维化[33]。因此，nARMD患者接受TGF-β抑制剂的治疗，可能在一定程度上延迟EMT和视网膜下纤维化的发生，从而获得更好的视力预后。可溶性极低密度脂蛋白受体(sVLDLR)是一种内源性Wnt信号抑制剂，研究发现过度激活Wnt信号通路可以增强TGF-β通路，而sVLDLR可能是部分通过抑制Wnt信号通路达到抑制nARMD中视网膜下纤维化进展的目的[34]。

TGF-β在nARMD中可能具有促血管生成功能。通过靶向激光损伤RPE和Bruch膜诱导CNV生成的动物模型是研究nARMD的金标准动物模型，研究发现在小鼠CNV形成过程中TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达明显上调，而对照组正常小鼠的TGF-β为低表达水平；此外，通过腹膜内或玻璃体内注射TGF-β抑制剂LY2157299可以下调视网膜中VEGF-A和TNF-α的表达水平，这有助于预防或阻止早期CNV形成与进展[35]；且研究证实nARMD患者房水、玻璃体液及黄斑RPE中TGF-β表达显著升高[36]，表明抑制TGF-β信号通路对于nARMD的治疗具有潜在意义。目前有争议的是有研究支持TGF-β在nARMD中还有抗血管生成功能。在转基因小鼠模型中，过度表达的活性TGF-β1可诱导脉络膜毛细血管萎缩而未发现任何CNV迹象[37]；在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，腹膜内注射人胎盘羊膜来源的间充质干细胞迁移到视网膜中并通过TGF-β1表达可以抑制CNV的形成[38]；这可能与TGF-β1通过抑制微血管内皮细胞增殖并下调局部VEGF和VEGF受体的表达水平有关。因此，多数学者认为在nARMD早期阶段，TGF-β显示出抗血管生成功能，而在类似于急性损伤或晚期阶段TGF-β则促进血管生成[36]，如何选择靶向TGF-β的治疗还需要更多有针对性的研究阐明其具体作用机制。

4.3TGF-β与PDR 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的慢性神经及微血管并发症之一，并且仍然是全球导致视力丧失和失明的主要眼底疾病之一。糖尿病会改变视网膜正常的细胞间相互作用，并导致严重的微血管异常，血-视网膜屏障破坏和神经元功能受损；随着病情进展，视网膜缺血缺氧加重，释放大量VEGF、炎症及纤维化因子，促进视网膜新生血管、纤维血管膜形成，导致玻璃体积血甚至牵拉性视网膜脱离，这表明已发展至PDR阶段，视觉严重受损且预后很差[39]。Ahmed等在14例PDR患者的纤维血管膜中发现，内皮细胞及循环纤维细胞可以经EMT分化肌成纤维细胞并促进PDR中的视网膜病理性纤维化，同时体外研究也证实暴露于TGF-β1、结缔组织生长因子、白细胞介素-1β及TNF-α条件下的人视网膜微血管内皮细胞形态改变，失去内皮细胞标志物(内皮型一氧化氮合酶和血管内皮钙黏蛋白)的表达并开始表达间充质标志物(α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞特异性蛋白-1)[40]。肌成纤维细胞可通过分泌MMP-2和MMP-9促进内皮细胞迁移并释放大量VEGF，导致新生血管的形成[28]。TGF-β尤其是TGF-β2在PDR患者的玻璃体中表达上调，与PDR期间VEGF的产生密切相关。Braunger等[41]发现长时间缺乏TGF-β基因的TGFBR2小鼠模型表现出PDR的表型特征，视网膜有大量微动脉瘤、毛细血管渗漏和视网膜新生血管形成，血管平滑肌样细胞和增厚的基底膜替代分化的周细胞覆盖视网膜毛细血管管壁，在4月龄的TGFBR2小鼠模型中观察到终末期PDR表型特征，包括大量内皮细胞丢失、视网膜新生血管形成导致视网膜脱离及玻璃体积血等。此外，TGF-β可通过结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)发挥促纤维化作用，且CTGF在晚期PDR发生的血管纤维化转换中十分关键。糖尿病大鼠视网膜中TGF-β表达上调，CTGF mRNA表达增加，终末期PDR模型中TGF-β在瘢痕样纤维膜中表达显著上调[42]。

内皮素(endothelin，ET)是一种有效的血管收缩剂，以3种同种型存在，即ET-1、ET-2和ET-3，其中ET-1及其受体ETA已被证明可介导高血糖和DR期间视网膜血流减少[43]，DR早期阶段，ET-1可通过受体ETA介导周细胞凋亡[44]；William等发现PDR增殖膜中ET-1和成纤维细胞免疫染色比特发性前膜中更明显，且ET-1和S100A4(成纤维细胞标志物)染色共定位表明ET-1在PDR中上调并可能参与TGF-β介导的成纤维细胞的转变与增殖，故ET-1有可能成为防治PDR的潜在靶点[45]。一项临床对照研究发现，血清TGF-β1可以成为预测PDR进展的生物标志物，且可以作为评估抗VEGF治疗后临床疗效的指标[46]。也有研究显示，PDR及合并新生血管性青光眼的PDR患者房水中TGF-β水平明显升高，检测房水TGF-β水平有助于及时调整治疗方案和监测治疗反应[47]。

5小结与展望

TGF-β信号通路介导的纤维化在PVR、ARMD及PDR等增殖性视网膜疾病的发病机制中十分关键，RPE细胞EMT过程及ECM的过量积累是纤维化的两个主要特征表现；阻断TGF-β及其下游通路中蛋白激活的抑制剂可能是防治增殖性视网膜疾病的潜在治疗靶点之一，然而，基于TGF-β信号通路中调节因子的多样性和潜在信号传导途径的复杂性，抑制视网膜组织病理性纤维化可能需要多种因素的联合靶向治疗。特异性阻断参与肌成纤维细胞转分化的下游TGF-β信号通路，保留视网膜稳态内环境及正常功能所需的TGF-β信号通路可能更有利于增殖性视网膜疾病的早期防治。随着有关纤维化眼病发病机制的深入研究，我们期望能够研发出新的有效的对抗病理性纤维化的药物及手段，助力于临床上增殖性视网膜疾病的防治。