GATA6抑制肝星状细胞活化在胆道闭锁肝纤维化中的研究进展

杨仁杰，张聪，詹江华

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是以肝内外胆管进行性炎性阻塞和肝纤维化为特征的小儿肝胆外科疾病，是引起婴幼儿梗阻性黄疸的常见原因之一［1-3］。肝门空肠吻合术（Kasai术）被公认为BA患儿的首选治疗手段，能够改善胆汁引流、逆转胆汁淤积、延长患儿自体肝生存时间，但远期自体肝生存情况仍不理想，最终需要肝移植来挽救生命［4-6］。GATA结合蛋白（GATA binding protein，GATA）6具有调节转录活性的功能，可抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化并参与BA肝纤维化进程。本文就GATA6的功能特点、作用途径及在胆道闭锁肝纤维化中的作用进行综述。

1 GATA6的结构特点和功能

GATA家族是一组与DNA共有序列GATA结合的转录因子，因其保守的结合模序（A∕T）GATA（A∕G）而得名，是细胞分化和整个生殖轴上成年基因表达调控的关键因素，在胚胎发育中主要参与细胞增殖和分化的调控［7］。脊椎动物GATA基因家族包括6个分子，可能是由脊椎动物谱系进化早期发生的2次主要基因复制事件形成的：第一次复制产生了GATA1、GATA2和GATA3，主要表达于造血系统、神经系统和免疫系统，对造血细胞与淋巴细胞的分化具有重要作用；第二次复制产生了GATA4、GATA5和GATA6，主要在脊椎动物的肝脏、胆道、胰腺、心脏、肺、肠道、生殖腺中表达，通过与其他组织中富集的转录因子相互作用发挥发育调控功能［7-8］。

1.1 GATA6的结构特点 GATA6是GATA转录因子家族一员，包含由2个锌指（zinc finger）组成的高度保守的DNA结合结构域（DNA binding domain，DBD）——Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys［9］。靠 近羧基端（C-terminus，C-端）的锌指结构称为Cfinger，主要负责特异识别WGATAR（W=A或T，R=A或G）DNA碱基序列，从而使其结合到特定的GATA结合位点；靠近氨基端（N-terminal，N-端）的锌指结构称为N-finger，主要通过与GATA蛋白辅因子的结合来调节C-finger的DNA结合能力。

1.2 GATA6的功能和作用 GATA6在肝脏、胰腺等器官的发育中发挥调控作用［10］。肝脏发育主要包括内胚层肝脏特化、肝芽生长、肝母细胞增殖分化以及肝脏形态发生4个阶段，整个过程离不开GATA家族、叉头框A蛋白（forkhead box A，FoxA）家族和肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）家族等肝内富集转录因子间形成的复杂网络的调控，其中GATA6作为谱系特化因子、染色质重塑因子、多能性因子和“先锋因子”，在肝脏发育各阶段发挥关键调控作用，是肝脏发育早期阶段所必需的少数因子之一，通常情况下通过与其他转录因子或信号分子的相互作用来发挥调控功能［11-12］。有学者通过对组蛋白3赖氨酸4二甲基化和组蛋白3赖氨酸27乙酰化标记的表观遗传学分析，鉴定出GATA6是小鼠和人HSCs谱系的调节因子之一，在维持静息样HSCs表型中发挥关键作用［13］。HSCs具有转分化为肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFB）的能力，已被证实为肝纤维化的主要效应细胞，HSCs活化导致的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝内过度积聚和沉积是肝纤维化发生发展的关键环节［14］。在四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化模型中，敲除GATA6转录因子的小发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）可导致促纤维化因子表达水平增高，HSCs激活，加重了CCl4诱导的小鼠肝纤维化，即使停止CCl4对肝脏的损伤，肝纤维化程度也未见明显减轻，表明GATA6是肝星状细胞失活和肝纤维化消退所必需的，在肝损伤后HSCs发育过程中发挥关键作用［13，15］。GATA6除调节转录活性功能，还具有细胞定型、谱系转换和转分化方面的作用，可启动细胞命运转变开关［16］。

2 BA肝纤维化

BA患儿由于感染病毒引发固有或适应性免疫反应，导致机体内炎症介质增多、T细胞减少，使胆管结构受到破坏或发育停滞，引起免疫反应和炎症反应，损伤胆管上皮细胞，并促进肝细胞释放各种促炎因子、细胞因子、免疫产物，诱导反应性胆管增生或肝祖细胞增殖，进而促进BA肝纤维化，胆管上皮损伤是BA肝纤维化的重要启动因素［17］。

2.1 BA肝纤维化特点 BA肝纤维化是由多种因素参与、受多种基因调控导致的慢性轻中度肝损伤，伴随肝脏内部瘢痕形成，其过程复杂，进展较快，早期行Kasai术仅改善了胆汁引流，而不能阻止肝纤维化进展，导致远期自体肝生存情况不理想，最终需肝移植来挽救生命［5，18］。因此，BA肝纤维化机制成为小儿外科领域研究的重点，以期发现有效遏制肝纤维化的靶点，提高BA患儿自体肝生存率。

2.2 HSCs活化促进BA肝纤维化 转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是促进BA肝纤维化进程的一个关键因子，可由浸润细胞（如淋巴细胞、单核细胞∕巨噬细胞）、HSCs、肌成纤维细胞和血小板等合成及分泌，当肝脏受到损伤时，这些细胞都是TGF-β1的潜在来源［19-20］。巨噬细胞通过产生大量的炎性因子，如TGF-β1、白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-4、IL-6等诱导HSCs活化，激活的HSCs增殖并迁移至门管区或实质ECM，产生并积累过多的纤维结缔组织，形成纤维状瘢痕，增殖的HSCs同时经历表型转化形成肌成纤维细胞，肌成纤维细胞分化导致胆道纤维化、肝纤维化、肝硬化，HSCs一旦激活也可不断分泌TGF-β1等，起到自身激活的作用，使这一过程持续下去［21］。此外，在肝脏损伤后，树突状细胞（dendritic cells，DCs）通过分泌促炎因子，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）激活HSCs、T细胞，加剧肝纤维化。促进肝纤化进程的另一个关键因子纤维结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）也能通过调节HSCs的活化以促进肝纤维化的发生。这两个关键因子在胆道上皮细胞和肝细胞上均有表达，并随着肝纤维化程度的加重而愈加明显。在慢性肝损伤中，血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）刺激HSCs释放出纤维化的细胞外囊泡，HSCs自噬在维持肝脏稳态中发挥重要作用，其自噬抑制纤维化因子的释放，从而减轻肝纤维化［3，21-22］。

3 GATA6与BA肝纤维化

胆管上皮损伤是BA 肝纤维化的重要启动因素，HSCs的活化是肝纤维化形成和发展的核心，GATA6参与调控细胞增殖、分化，与炎症反应、HSCs活化、肝纤维化分期及肝损伤后修复等密切相关，可减轻肝细胞凋亡和纤维化损伤，是HSCs失活和肝纤维化消退所必需的，在肝损伤后调节HSCs发育过程中发挥关键作用。

3.1 GATA6与HSCs活化 在胚胎发育早期，GATA6表达于胚胎肝细胞和成体肝细胞，且能够与FoxA、HNF、骨形态生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等信号分子相互作用，调控肝脏发育并影响肝脏特化，随着增殖迁移，肝母细胞分化为肝细胞和胆管上皮细胞［23-25］。在肝脏发育早期，GATA6在胆管细胞和肝细胞中均有明显表达，但在发育晚期仅表达于胆管细胞。Soini等［26-27］研究发现BA肝中GATA6表达上调后，已知的胆管细胞分化调节因子锯齿状蛋白1（jagged protein 1，JAG1）、肝细胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor 1β，HNF1β）和HNF6表达也上调，Kasai术使血清胆红素正常化后GATA6表达降低，表明GATA6是BA中肝细胞导管化生的一个新的标志物和潜在的诱导剂。研究表明，JAG1、HNF1β和HNF6分别通过Notch信号通路、HNF6∕HNF1β级联反应广泛表达于多种组织器官，参与调控细胞增殖、分化和生长发育，减轻肝细胞凋亡和纤维化损伤［28-30］。HSCs的活化在不同病因的肝纤维化中起着核心作用。有学者研究发现在激活的HSCs中检测到146个上调基因和18个下调基因，这些基因也与肝纤维化有关，在这些重叠基因中，7个转录因子编码基因（其中包括GATA6）被上调，1个类视黄醇X受体α（retinoid X receptorsα，RXRA）被下调，而GATA6是HSCs失活和肝纤维化消退所必需的，在肝损伤后调节HSCs发育过程中发挥关键作用［31］。推测GATA6在BA肝纤维化进程中与JAG1、HNF1β和HNF6有相同或相近的作用，并在肝损伤肝再生过程中发挥作用，但具体是通过何种信号通路参与的BA肝纤维化进程仍需要进一步探索。

3.2 GATA6与HSCs衰老

3.2.1 GATA6促进HSCs衰老 HSCs的活化是肝纤维化进程中的关键环节，抑制HSCs增殖、促进活化的HSCs衰老可能成为肝纤维化防治的新策略［32］。细胞衰老是细胞受到某些特定的刺激，如氧化应激、DNA损伤、端粒侵蚀、染色质破坏等而被激活的一种终末应激激活程序，主要受p53和p16INK4a肿瘤抑制蛋白的调控［33］。在肝纤维化的发展过程中存在衰老细胞，这些细胞主要来自活化的肝星状细胞，最初因肝损伤而增殖并沉积在纤维化肝脏的ECM中，衰老激活的HSCs可减少ECM成分的分泌，增强免疫监视，促进纤维化的逆转［32］。Zhang等［34］研究发现双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）可以诱导HSCs衰老，并确认转录因子GATA6是促进DHA诱导的HSCs衰老的上游分子，该研究发现DHA在体外和体内都需要GATA6的积聚才能诱导衰老标志物p53、p16、p21和高迁移率族蛋白组A1（high mobility group protein A1，HMGA1）基因表达上调，促进HSCs衰老。

3.2.2 GATA6促进HSCs衰老的途径 用GATA6siRNA预处理细胞后，DHA对活化的HSCs中p53和p16表达的促进作用明显减弱，有证据表明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）在p53和p16的激活中起着重要作用［35-36］。MAPKs在真核细胞中有4条信号转导通路，即细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）p42∕p44通路、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和（或）应激活化蛋白激酶（stress-activated MAP kinases，SAPK）通路、p38通路和ERK5∕大丝裂原活化蛋白激酶1（big MAP kinase1，BMK1）通路，它们通过转录因子磷酸化而改变基因的表达水平，可介导细胞生长、增殖、分化、死亡及细胞间的功能同步等多种生理病理过程；研究显示GATA6过表达可显著提高磷酸化JNK1∕2（p-JNK1∕2）的表达水平，激活JNK1∕2信号，调节自噬活性，但对磷酸化ERK1∕2（p-ERK1∕2）和磷酸化p38（p-p38）的表达无明显影响；JNK1∕2抑制剂抑制了JNK1∕2的活性，阻断了GATA6或DHA诱导的p53和p16表达上调，证明JNK1∕2参与并介导GATA6诱导的p53和p16表达上调；上述结果提示GATA6过表达可能通过MAPKs依赖的机制参与DHA诱导的HSCs衰老［34］。

3.3 GATA6协同上调铁调素表达抑制HSCs活化

3.3.1 铁调素（hepcidin，Hepc）表达减少与肝纤维化铁代谢紊乱相关 近年来研究表明，多种导致肝纤维化的慢性肝病均与肝脏铁代谢紊乱有关，肝脏过多的铁沉积可引起活性氧增加，促进HSCs活化，造成肝纤维化；而HSCs活化使肠道内铁的吸收和巨噬细胞对铁的释放相对不平衡，进一步加重肝纤维化；Hepc是铁的负性调节激素，其表达的减少与各种慢性肝纤维化疾病铁代谢紊乱的发生密切相关［37］。Hepc是由人类抗菌肽编码基因（human antimicrobial peptide，HAMP）编码的25个氨基酸残基组成的抗菌肽激素，是主要由肝细胞在铁含量失衡、炎症或缺氧状态下分泌的一种铁调节肽，在铁代谢中起着核心作用［38］。

3.3.2 Hepc在肝脏中的表达途径 Hepc在肝脏中的表达可通过两个主要途径诱导：TGF-β信号通路中骨形态生成蛋白-6（bone morphogenetic protein 6，BMP-6）介 导 的HJV∕BMP∕Smad途 径 和JAK-STAT信号通路介导的炎症途径（主要通过IL-6）［39］。研究表明，BA胆汁淤积过程中可通过抑制IL-6信号通路、阻断磷酸化细胞信号传导和转录活化因子3（phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，pSTAT3）信号转导而下调Hepc的表达，说明在胆汁淤积过程中增加Hepc的表达可能有助于减轻BA引起的胆汁淤积性肝损伤［40］。

3.3.3 GATA6协同上调Hepc抑制HSCs活化 在慢性肝病肝细胞中GATA4和GATA6与GATA蛋白辅因子共同调节HAMP的转录。Bagu等［39］研究了GATA及其辅因子蛋白与IL-6和BMP-6处理后Hepc表达的相关性，发现无论用IL-6还是BMP-6处理Huh-7人肝癌细胞，都能提高HAMP启动子的活性；将HAMP启动子与GATA4和GATA6共转染后，IL-6或BMP-6处理后的HAMP启动子活性进一步增强；但将HAMP启动子与GATA的辅因子蛋白1或辅因子蛋白2共转染则抑制了HAMP启动子对IL-6或BMP-6处理的反应；GATA和其辅因子蛋白对IL-6或BMP6诱导的启动子活性的影响可被HAMP启动子区-103∕-98的GATA反应元件TTATCT突变消除；在体内，脂多糖处理导致肝损伤的小鼠肝脏中GATA-6 mRNA的表达增加，而GATA-4 mRNA表达出现一过性下降，且与Hepc的表达呈正相关。该项研究结果表明，GATA6可能介导了出生后炎症期间肝细胞中Hepc的转录上调，且在炎症过程中与Hepc的表达呈正相关，与Hepc协同上调，进而明显抑制HSCs活化，减轻炎症反应，在一定程度上减轻肝纤维化［39］。

4 小结

综上所述，胆管上皮损伤是BA肝纤维化的重要启动因素，HSCs的活化是肝纤维化形成和发展的核心，GATA6参与调控细胞增殖、分化，与炎症反应、HSCs活化、肝纤维化分期及肝损伤后肝修复等密切相关，可减轻肝细胞凋亡和纤维化损伤，是HSCs失活和肝纤维化消退所必需的，在肝损伤后调节HSCs发育过程中发挥关键作用。在炎症反应、铁含量失衡或缺氧状态下，GATA6可协同上调抗菌肽激素Hepc的表达，通过MAPKs依赖的机制诱导p53和p16表达上调，抑制HSCs活化，促进HSCs衰老，减轻肝纤维化。GATA6是否还通过其他信号通路共同参与BA肝纤维化发展过程尚有待于进一步探究。