细胞因子在新生血管性年龄相关性黄斑变性中的作用研究进展

党美佳，张小用，李 静

(1.西安医学院，陕西 西安 710021；2.陕西省人民医院，陕西 西安 710068；3.西安医学院第一附属医院，陕西 西安 710077)

年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)是常见的视网膜变性疾病，可导致老年患者不可逆的中心视力丧失，是造成全世界老年人群发生不可逆性盲的主要原因。早期AMD临床症状有玻璃体和视网膜色素上皮的异常。晚期AMD可以是非新生血管性(也称为萎缩性、干性或非渗出性)或新生血管性(也称为湿性或渗出性)[1-2]。新生血管性AMD(Neovascular age-related macular degeneration，nAMD)以黄斑区脉络膜新生血管(CNV)、视网膜色素上皮脱离、黄斑区水肿和出血为主要特征[2]。晚期AMD可导致严重的永久性视力损害和失明，严重影响患者的生活质量和功能独立性。nAMD发病机制错综复杂，目前认为与患者的年龄、遗传、吸烟、氧化应激、免疫炎症反应、视网膜色素上皮细胞(RPE)老化和代谢异常等多因素综合作用有关[3]。细胞因子是一类在细胞信号传递过程中具有生物学活性的重要小分子多肽或糖蛋白，主要包括白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生长因子(GF)和趋化因子(CK)等。大量研究表明nAMD患者眼内多种细胞因子升高，细胞因子作为免疫和炎症反应的重要介质在nAMD发病机制中起重要作用。现就这些细胞因子在nAMD中的作用研究进展进行综述，以期为nAMD的治疗提供更多的思路和选择。

1 白细胞介素

IL由白细胞产生，又可作用于多种细胞，在激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化，参与造血、传递信息，以及炎症反应中起重要作用。Sakurada等[3-4]研究发现，IL-1α和IL-15在nAMD中的浓度均显著高于白内障，这一趋势在缺血/再灌注损伤大鼠模型的血浆中也观察到。已有研究证实了AMD的RPE细胞中PYD结构域包含蛋白3(NLRP3)炎症小体的激活，IL-1α被认为启动了视网膜中NLRP3炎症小体的组装，在RPE细胞中使用IL-1α启动炎症小体增加了RPE细胞对光氧化损伤介导的氧化应激造成的细胞死亡的敏感性，并将诱导细胞死亡的机制从凋亡改变为细胞焦亡。这一过程可能促进了AMD的RPE变性[5]。由于RPE细胞死亡是AMD进展的中心环节，IL-1α已被认为是控制无菌视网膜炎症的治疗靶点。

IL-18在AMD发病中的作用尚不清楚。Doyle等[6]证明IL-18前体诱导RPE细胞肿胀，导致细胞死亡。然而，将活性形式的IL-18注射到小鼠视网膜中并没有对组织造成损害。这与他们最初的发现一致，单独注射IL-18或联合抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗减少了激光诱导的CNV小鼠模型中的新生血管，IL-18在血管生成和新生血管形成中的作用已得到证实[7]。这些研究结果表明IL-18对nAMD有保护作用。关于此观点，不同的研究说法不一。Tarallo等[8]报道，AMD患者捐赠的眼睛中Disher酶的表达减少，由于Alu RNA的积累，这种酶的减少足以诱导RPE损伤，该小组证明了Alu诱导的RPE毒性依赖于NLRP3炎症小体成分的表达，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和人细胞凋亡相关斑点样蛋白(PYCARD)。为了验证IL-18的保护作用假说，这个小组给缺乏Caspases-1的小鼠注射了IL-18，发现仍然引起了类似于Alu RNA积累的RPE损伤。多项研究[9-10]发现NLRP3炎症小体是AMD发生的中心。炎症小体通过将两种主要的促炎细胞因子IL-1β和IL-18从不活跃的前体细胞裂解成为成熟的细胞因子来控制它们的成熟。控制炎症小体的激活实际上是控制AMD中IL-18的水平，从系统上看它是nAMD疾病进展的一个关键介质。

Mimura等[1]研究表明，nAMD组房水中IL-6和IL-8平均水平大约是白内障组的2～4倍。Seddon等[11]研究证明IL-6升高可能作为nAMD进展的标志。IL-6和IL-8是巨噬细胞和其他细胞产生的趋化因子，主要参与炎症反应调节，具有调节免疫应答、急性期应答、抗感染免疫等功能，特别是在固有免疫应答中发挥重要作用[12]。IL-6是引起内皮通透性增加的重要介质，可以通过内皮细胞形态的改变和肌动蛋白丝的重排来诱导血管内皮通透性的增加。研究[13-14]显示IL-6对于脉络膜血管生成既是必要的，也是充分的，它可通过IL-6R和巨噬细胞的经典激活刺激脉络膜血管生成，然后刺激血管生成。然而，Klein等[15]发现血浆IL-6水平与nAMD进展间没有显著联系。Sato等[16]研究则认为IL-6水平是nAMD进展的负性因素。

Mimura等[1]研究表明nAMD患者房水中IL-8浓度较健康对照组显著升高。IL-8在多种视网膜疾病中发挥着重要的作用，对中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞有强大的趋化和激活作用。此外，IL-8能够促进黏附分子表达，在新生血管形成中有重要作用。研究发现，大部分IL-8都聚集在RPE的脉络膜面，IL-8基因可能是参与AMD发展的重要基因。

2 干扰素

IFN是内源性细胞因子，表现出有效的免疫调节、抗病毒和抗增殖特性。IFN-α和IFN-γ有促炎作用，而IFN-β主要作用是免疫调节。Afarid等[17]研究发现，nAMD患者血清IFN-β水平高于干性AMD。IFN受体激活可以诱导典型的JAK-STAT或替代信号通路，它们的协同作用导致多效性细胞反应，从而产生不同的生物反应。替代补体途径、免疫细胞激活和自身免疫都是现已证实的nAMD重要的相关发病机制。有强有力的证据表明，IFN-β对小胶质细胞有免疫调节作用，可对抗中枢神经系统的自身免疫[18]。在nAMD的发展过程中，人补体因子H(CFH)在RPE细胞中过度表达可趋化单核细胞并诱导RPE细胞的趋化性迁移，是重要的免疫相关因素。IFN可显著上调RPE细胞中CFH的表达，IFN-β给药在nAMD的激光模型中发挥了积极的治疗效果，有效地减弱了小胶质细胞和巨噬细胞的反应以及CNV的形成。Mo等[19]研究表明，IFN-γ可以过度表达IFN-γ诱导蛋白10(IP10)作为AMD的生物标志物。

如今，血管内皮生长因子(VEGF)被认为是导致CNV进展的因素。Sun等[20]研究表明，某些类型的IFN可以抑制VEGF的产生，视网膜中缺乏IFN信号可加速单核吞噬细胞反应并促进CNV。因此，IFN-γ可能对nAMD的进展产生重要影响。

3 肿瘤坏死因子

TNF是一种多效性促炎细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌。已观察到可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)和TNF-α间存在很强的相关性，血浆中sTNFRⅡ水平随着TNF-α水平的升高而升高。目前尚不清楚sTNFRⅡ是通过充当诱饵受体来抑制TNF-α功能，还是通过稳定血浆中不稳定细胞因子来促进TNF-α功能，从而导致持续的全身活动。IFN和TNF在体外诱导趋化因子、补体和VEGF上调。研究[21]表明TNF-α改变了RPE的VEGF分泌，TNF-α降低高极化RPE细胞中的VEGF分泌，但增加与c-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB (NF-κB)通路间的串扰相关的非极化RPE细胞中的VEGF分泌。这表明，在健康RPE中TNF刺激可防止CNV，但在受损RPE中TNF刺激可增强VEGF诱导的渗出过程。与此一致的是，CNV的存在与循环单核细胞中TNF-α含量较高有关。在CNV动物模型和nAMD人体组织中观察到巨噬细胞活化和M1表型极化，这也与高水平的TNF-α有关。鉴于早期nAMD中sTNFRⅡ的增加反映了TNF-α分泌的增加，这也与Faber C等的研究结果一致。nAMD患者血浆中sTNFRⅡ水平的升高是RPE和外周免疫细胞相互作用的结果，T淋巴细胞可以代表这种免疫细胞，因为已知这些细胞与RPE相互作用并分泌TNF-α。

4 集落刺激因子

促红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，传统上认为它只在体内产生红细胞。然而，随着视网膜层中EPO和EPO受体(EPOR)的发现，EPO似乎在眼睛中也具有生理作用。有研究[22]观察到EPO通过一种独立机制与VEGF一样有效地刺激血管生成，无论VEGF的诱导如何。在眼部，高水平的VEGF可由缺血、缺氧或高血糖引起，导致血管渗漏和新生血管形成，这在眼部疾病(如糖尿病视网膜病变和AMD)中非常明显。因此，在DR和AMD患者中，以VEGF为靶点管理视网膜新生血管一直是减少糖尿病黄斑水肿和脉络膜新生血管的策略。然而研究[22]表明，VEGF本身并不能完成血管生成，因此寻找其他同样有助于血管生成的因子已经揭示了EPO的参与。在缺氧条件下，缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的激活可引起血管生成，并促进VEGF转录的表达。同时，EPO的调节也由HIF-1α的控制介导[23]。因此，EPO与EPOR的结合可能具有诱导新生血管形成的潜力。也有研究证实EPO通过抑制Caspase来保护视网膜细胞免受光、缺氧、高氧和过氧化氢诱导的细胞凋亡，并通过VEGF和血管紧张素途径上调血管生成反应。视网膜中EPO的表达以及随后的丝/苏/酪氨酸激酶磷酸化可能与氧化应激反应密切相关，从而实现分子水平上对细胞凋亡和血管生成的双重作用[22]。

Schwarzer等[24]研究发现，集落刺激因子-1受体(CSF-1R)抑制剂PLX5622对CSF-1R的抑制导致CNV的更快消退。另外，研究显示CSF-1诱导人单核细胞产生VEGF和血管生成活性，抑制CSF-1R可降低VEGF水平。因此，阻断受体可能影响由表达CSF-1R的细胞介导的血管生成。

5 生长因子

有研究发现AMD患者眼房水VEGF、VEGF受体(sVEGFR-1和sVEGFR-2)水平显著高于白内障对照眼。在nAMD患者中，新生血管从脉络膜生长到视网膜下区域。这些与CNV相关的异常血管具有多孔壁，与视网膜下出血或液体渗漏相关。VEGF已被确定为AMD中CNV发展的关键分子，这一点在兔CNV形成中也已被证实[1，25]。在培养的人视网膜内皮细胞中，VEGFR-1和VEGFR-2的激活通过降低闭合蛋白水平导致紧密连接中断，因此VEGF受体信号通路在血-视网膜屏障功能障碍的发展中起着关键作用。在培养的牛视网膜内皮细胞中，VEGF诱导sVEGFR-2磷酸化和下游信号级联的激活，包括蛋白激酶C-细胞外信号调节激酶1/2。此外，抑制VEGF-VEGFR-2信号传导可阻止视网膜内皮细胞间紧密连接蛋白[包括闭锁小带-1(ZO-1)、ZO-2和闭合蛋白]的丢失，并防止血-视网膜屏障被破坏。在动物模型中，局部或全身使用低分子量VEGFR-2/Src激酶抑制剂可防止VEGF诱导的血管通透性增加，阻断血管生成，并减少视网膜水肿。

转化生长因子(TGF)家族成员具有多效性，在调节血管内皮细胞和平滑肌细胞方面可能具有不同的作用，它们的促血管生成和抗血管生成作用依赖于环境。Tosi等[26]研究发现，nAMD患者房水中TGF-β1浓度明显高于白内障对照组，表明TGF-β1参与nAMD的形成。已证明生理条件下TGF-β2在房水中表达，通过对量化激活的TGF-β2和TGF-β2的总蛋白浓度进行研究，证实了Bai等的研究数据[27]。他们记录到nAMD患者玻璃体TGF浓度增加，在人类手术切除的CNV组织中也记录到TGF-β表达增加[28]。它不仅通过RPE诱导VEGF-α表达，而且其直接和间接抑制作用也与抑制上皮间质转化、RPE细胞衰老以及阻断CNV有关[29]。然而，研究[30]表明TGF-β在眼中可作为抗血管生成因子并保护RPE细胞和视网膜血管系统。

6 趋化因子

趋化因子由组织细胞和白细胞产生，结合到与其连接的G蛋白偶联受体上可引起细胞反应，如迁移、黏附或趋化。趋化因子根据其氨基端(N端)半胱氨酸的排列方式，可分为CXC、CC、XC和CX3C四个亚族。研究表明趋化因子信号在年龄相关视网膜疾病中起作用。利用小鼠激光诱导的CNV模型对RPE细胞中趋化因子表达进行研究，微阵列分析显示CXCR3表达增加，表明某些趋化因子/趋化因子受体与CNV有关[31]。

单核细胞是趋化因子的代表，炎症发生时单核细胞被募集到血管炎症部位，这些细胞可能有助于血管生成和伤口愈合。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是一种有效的趋化因子，在健康视网膜中表达较少。然而，在血管生成的早期阶段,损伤模型如激光诱导了依赖于CCL2/CCR2途径的单核细胞/巨噬细胞的迁移和浸润，从而导致光受体的MORT(一种死亡域蛋白，促进Fas蛋白所在细胞的凋亡发生)激活，促进CNV的进展。研究[1]发现nAMD患者房水中和血清中的MCP-1浓度明显高于对照组。此外，nAMD患者的眼内MCP-1浓度与黄斑厚度和黄斑水肿严重程度显著相关。这些结果表明，MCP-1直接负责CNV和AMD周围的成膜。利用人类细胞进行的体外研究[32]表明，MCP-1由视网膜微血管内皮细胞和RPE细胞组成性表达，其分泌被其他促炎分子增强。从小鼠RPE细胞释放的MCP-1在体外激活小鼠眼巨噬细胞，并可消化RPE和基底膜中的纤维连接蛋白。

7 结 语

目前的研究表明，多种细胞因子在眼内表达增加，这些细胞因子可能影响nAMD各个阶段的进程。在nAMD的进展中，这些细胞因子的作用可能是可变的，而且有时是相反的。需要进一步的研究来了解细胞因子在nAMD发病机制中的作用，以及它们如何与nAMD中其他重要因素相互作用，如氧化损伤、补体激活、细胞死亡和血管生成。以这些细胞因子及受体为靶点可能成为发现新的疾病途径和治疗方法的关键。