芩柏汤通过调节TLR2/IκB-α/IL-1β通路保护溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜的研究

刘 雯， 侯晨辉， 李 江

(1.郑州铁路职业技术学院护理学院，河南 郑州 451460；2.河南省天然药物提取和医疗技术应用工程研究中心，河南 郑州 451460)

溃疡性结肠炎是一种临床常见的慢性非特异性炎症性疾病，我国患病率约为1/10 000[1]，在溃疡性结肠炎患者中，约46%的患者表现为慢性复发型，病情反复，迁延难愈[2]。近年来中医药治疗溃疡性结肠炎的研究得到了长足的进展，其优势也逐渐被认可[3-4]。芩柏汤是根据芩柏颗粒组方加减所得的中药汤剂，可清热燥湿、活血化瘀、润肠通便，有研究显示芩柏汤治疗溃疡性结肠炎有确切效果，可保护结肠黏膜[5]。Toll样受体2(TLR2)可通过细胞膜外区富含亮氨酸的重组序列识别配体，进而激活相关接头蛋白，上调核转录因子-κB(NF-κB)的表达，与此同时核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)磷酸化水平升高，可解离NF-κB的复合物，诱导基因转录，产生持续扩大的炎症反应，并增加白介素-1β(IL-1β)表达[6-7]。有研究显示，抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路中TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β表达可降低血清IL-1β、IL-4水平，升高IL-10水平，减轻炎症反应，保护溃疡性结肠炎模型的肠黏膜[8-10]。因此，本展开了对芩柏汤保护溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜的机制研究。

1 材料

1.1 动物 54只清洁级SD成年大鼠，7～9周龄，雌雄各半，体质量184～226 g，购自上海加科生物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2020-0001。大鼠饲养于河南中医药大学医学实验动物中心，自由饮食(标准饲料)与进水(高压灭菌水)，温度20～25 ℃，相对湿度40%～60%，12 h光照/12 h黑暗，适应性喂养1周。参照3R原则设计实验，本实验已经河南省实验动物医学伦理委员会审批通过[(准字)R201902-003]。

1.2 试剂与药物 美沙拉嗪(葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，批号190516)；芩柏汤药材(广东省惠州市中药厂有限公司，经河南中医药大学纪宝玉副教授鉴定合格)。大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-10酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号20200710A、20200412C、20200318A)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(上海西唐生物科技有限公司，批号200613)；TRIzol试剂(北京莱博润科生物科技有限公司，货号R20200127)；兔抗鼠TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α单抗，羊抗兔TLR2、IκB-α、NF-κB、IL-1β、p-IκB-α多抗(英国Abcam公司，批号20200113、20200221、20200117、20200312、20200514，20200226、20200126、20200415、20200412、20200511)。三硝基苯磺酸(TNBS)(北京谱朋科技有限公司，货号200111)；无水乙醇(货号G20200418)。

1.3 仪器 2164型超净工作台(美国BioX科技有限公司)；LC-2030型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；硅胶管(东莞泰同实业有限公司)；AB126型大鼠保温灯(北京中西远大科技有限公司)；BH2-UMA型光学显微镜(日本Olympus公司)；T100型聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪、Turbo型转膜仪(美国Bio-Rad公司)；Mixer型匀浆仪(美国OMNI公司)；NanoDrop型超微量紫外线分光光度计(美国Thermo公司)；LKB2050型蛋白质电泳仪(瑞典pharmacia LKB公司)；PHOTOCHEM型化学发光仪(德国耶拿分析仪器股份有限公司)。

2 方法

2.1 芩柏汤制备 称取党参、炒白术、生黄芪各20 g，当归、丹参各12 g，黄芩、黄柏、秦艽、防风、泽泻、制大黄、玄胡各10 g，桃仁6 g，加水浸泡30 min，煎煮30 min，取200 mL煎煮液，同法再次煎煮取200 mL煎煮液，混匀后过滤，水浴加热浓缩至每1 mL含1 g生药。

2.2 造模、分组与给药 将54只SD大鼠随机分为2组，其中9只记为正常组，余45只采用TNBS/乙醇联合法建立溃疡性结肠炎大鼠模型[11]，造模前禁食不禁水24 h，取5% TNBS与无水乙醇1∶1混合，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取经过石蜡油润滑的硅胶管(长约12 cm，直径2.0 mm)，经肛门轻插入大鼠体内约8 cm，将上述混合液按照100 mg/kg剂量经硅胶管注入，正常组同法注入等量生理盐水，均提起尾部倒置10 min后仰卧归笼，保温灯照射至大鼠自然苏醒。3 d后于造模大鼠中随机取1只颈椎脱臼法处死，经病理检查确认是否造模成功。将剩余造模大鼠按随机数字表法分为5组，即模型组，美沙拉嗪组，芩柏汤低、中、高剂量组。美沙拉嗪组予以5%美沙拉嗪混悬液2 mL灌肠，芩柏汤低、中、高剂量组予以6%、12%、24%芩柏汤混悬液2 mL灌肠，模型组和正常组予以蒸馏水2 mL灌肠，每天2次，共给药3周。

2.3 疾病活动指数(DAI)评价大鼠一般情况 将体质量下降率<1%、≥1%且<5%、≥5%且<10%、≥10%分别评为0、1、2、3分；将大便性状正常、略松散、松散、腹泻分别评为0、1、2、3分；将大便正常、隐血阳性、肉眼出血、血便分别评为0、1、2、3分，计算上述3项评分总和，得分越高认为病情越严重[12]。

2.4 Luk评分评价大鼠结肠病变 脊椎脱臼法处死大鼠，取结肠剪开并以生理盐水冲洗，肠黏膜层向上平铺，观察其色泽、充血、糜烂及溃疡等情况。将无损伤、充血且无溃疡，充血且肠壁增厚但无溃疡，有1处溃疡但无肠壁增厚，有2处或以上溃疡/炎症，有2处或以上大溃疡和炎症，有1处溃疡/炎症沿结肠纵轴>1 cm分别评为0、1、2、3、4、5分；若沿肠纵轴损伤>2 cm，每超过1 cm增加1分(6～10分)[13]。

2.5 ELISA法检测血清炎症因子水平 取大鼠尾静脉血，3 500 r/min离心15 min(离心半径8 cm)，取上清液采用ELISA试剂盒检测血清IL-1β、IL-4、IL-10水平。

2.6 HE染色观察结肠黏膜病理变化 取大鼠结肠黏膜组织，中性甲醛固定，梯度乙醇脱水后透明、包埋，连续切片(5 μm)，苏木素染色，伊红复染，脱水，透明，中性树胶封片后高倍光镜下观察。

2.7 RT-qPCR法检测结肠黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相关基因mRNA表达 取大鼠结肠黏膜组织研磨匀浆，TRIzol法提取总RNA，采用超微量紫外线分光光度计定量后将其逆转录为cDNA，以其作为模板扩增。扩增反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次；最后54 ℃ 10 min。采用2-ΔΔCT法计算TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA相对表达。引物序列委托宝生物工程(大连)有限公司合成，具体信息见表1。

表1 引物信息

2.8 Western blot法检测结肠黏膜TLR2/IκB-α/IL-1β通路相关蛋白表达 取大鼠结肠黏膜组织提取总蛋白并定量，取50 μg上样，SDS-PAGE电泳，转膜，封闭1 h，加一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，暗室加发光剂，曝光后采用化学发光仪成像，并采用IPP6.0图像分析软件分析蛋白相对表达量及磷酸化水平。胞核NF-κB蛋白表达检测内参为H3，TLR2、IκB-α、胞浆NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表达检测内参为GAPDH。

3 结果

3.1 溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理情况 造模大鼠结肠黏膜及其下层有充血、水肿、大量炎性细胞浸润等现象，符合溃疡性结肠炎典型病理表现，见图1。

3.2 芩柏汤对溃疡性结肠炎大鼠DAI、Luk评分的影响 给药前后与正常组比较，各组大鼠DAI评分均升高(P<0.01)。给药后与正常组比较，模型组大鼠DAI、Luk评分均升高(P<0.01)；与模型组比较，美沙拉嗪组和芩柏汤各剂量组DAI、Luk评分均降低(P<0.01)；与美沙拉嗪组比较，芩柏汤中、高剂量组DAI、Luk评分均降低(P<0.01)，见表2。

注：A为肉眼观察结肠，B为结肠HE染色(×400，标尺50 μm)。蓝色箭头指示结肠黏膜水肿，红色箭头指示黏膜下层充血水肿、炎性细胞浸润。

表2 各组大鼠DAI、Luk评分比较(分,

3.3 芩柏汤对溃疡性结肠炎大鼠血清炎症因子水平的影响 给药前后与正常组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-4水平均升高(P<0.01)，血清IL-10水平均降低(P<0.01)；给药后与模型组比较，美沙拉嗪组和芩柏汤各剂量组血清IL-1β、IL-4水平均降低(P<0.01)，血清IL-10水平均升高(P<0.01)，见表3。

表3 各组大鼠给药前后血清炎症因子水平比较

3.4 芩柏汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织病理变化的影响 正常组大鼠结肠黏膜组织可见黏膜全层结构和血管纹理清晰，腺体规则排列，上皮细胞整齐紧密，杯状细胞丰富；模型组可见黏膜及其下层大量炎性细胞浸润，上皮细胞排列稀疏，大量腺体破坏，杯状细胞极少，有肉芽组织形成，且有严重充血、水肿、糜烂和溃疡表现；美沙拉嗪组和芩柏汤低剂量组可见部分炎性细胞浸润，组织有充血水肿，可见少量糜烂及溃疡；芩柏汤中剂量组可见少部分炎性细胞浸润，上皮细胞排列整齐，有充血、水肿；芩柏汤高剂量组可见极少炎性细胞浸润，上皮细胞排列整齐紧密，杯状细胞丰富，有轻微充血、水肿，见图2。

图2 各组大鼠结肠黏膜组织病理变化(HE染色，×400，标尺50 μm)

3.5 芩柏汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1βmRNA表达均升高(P<0.01)；与模型组比较，美沙拉嗪组和芩柏汤各剂量组结肠黏膜组织以上指标mRNA表达均降低(P<0.01)；与美沙拉嗪组比较，芩柏汤中、高剂量组结肠黏膜组织以上指标mRNA表达均降低(P<0.01)，见表4。

3.6 芩柏汤对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织TLR2/IκB-α/IL-1β通路相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜组织TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表达均升高(P<0.01)，p-IκB-α/IκB-α蛋白表达比值与胞浆NF-κB蛋白表达均降低(P<0.01)；与模型组比较，美沙拉嗪组和芩柏汤各剂量组结肠黏膜组织TLR2、IκB-α、胞核NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表达均降低(P<0.01)，胞浆NF-κB均升高(P<0.01)，芩柏汤中、高剂量组p-IκB-α/IκB-α蛋白表达比值均升高(P<0.05，P<0.01)，见图3～4、表5。

表4 各组大鼠结肠黏膜组织TLR2、NF-κB、IκB-α、IL-1β mRNA表达比较

图3 各组大鼠结肠黏膜组织TLR2、IκB-α、胞浆NF-κB、IL-1β、p-IκB-α蛋白表达

图4 各组大鼠结肠黏膜组织胞核NF-κB蛋白表达

4 讨论

美沙拉嗪属于柳氮磺胺砒啶治疗溃疡性结肠炎的活性成分，因此本研究选用其作为对照药物[14]，但其仅对轻中度溃疡性结肠炎患者有效[15]。中医将溃疡性结肠炎归属于“泄泻”“肠癖”范畴，脾气虚弱，湿邪旺盛，湿蕴化热，血分受累，及肝肾，易致血瘀[16]；肠癖多因气虚夹湿、气血瘀滞、久病入络，则病程蔓延，迁延难愈，形成“虚中有实”“虚实夹杂”之症[17]。因针对此类病症应以健脾益气、补虚祛湿为重，兼活血祛瘀。

表5 各组大鼠结肠黏膜组织TLR2/IκB-α/IL-1β通路相关蛋白表达比较

本研究发现美沙拉嗪和芩柏汤均可改善溃疡性结肠炎大鼠的一般状况，减轻结肠黏膜病理改变和炎症反应。芩柏汤中党参健脾益气、生津润燥，将党参、黄芪合用益气扶正、托毒外出；白术甘温补中、温苦燥湿，兼具益气补脾、行水燥湿之效；黄芩、黄柏合用清热燥湿、祛火解毒；丹参活血化瘀、行气祛瘀；以玄胡、防风、秦艽、泽泻佐之，玄胡行气活血，防风祛风止痛，秦艽胜湿健脾，泽泻利水渗湿；大黄为使药，泻火解毒、导热外出、凉血祛瘀。诸药合用，共奏健脾补虚、祛瘀除湿之效。此外，党参可抗溃疡，修复受损的肠黏膜，还可减轻炎症反应[18]；黄芪可调节机体体液和细胞免疫，降低血清促炎因子水平，改善肠黏膜功能[19]。因此芩柏汤治疗溃疡性结肠炎有确切效果。

目前TLRs介导的免疫信号转导效应在溃疡性结肠炎发生发展中得到了广泛关注[20-21]。TLR2可识别配体，导致IκB-α被激活，调控NF-κB转录[22-24]。Bank等[25]证实抑制TLR2表达可减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织炎症浸润。IκB-α，发生磷酸化进而从NF-κB中解离，NF-κB暴露核定位点，使得胞浆中的NF-κB迅速向细胞核移位，诱导基因转录，增加IL-1β表达。过量的TLR2可导致NF-κB过度激活，产生持续扩大的炎症反应，使得促炎症细胞因子IL-1β、IL-4水平增加，而IL-10水平降低[26-27]，本研究结果与上述报道相符。本研究发现，模型组IκB-α、p-IκB-α蛋白表达均较正常组升高，而p-IκB-α/IκB-α较正常组降低，与上述趋势相反，可能是因为溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织在发生炎症反应同时，可能也存在拮抗炎症的自我保护作用。本研究还发现，中、高剂量芩柏汤可降低p-IκB-α表达，下调胞核NF-κB蛋白表达，增加胞浆NF-κB蛋白表达，减轻炎症反应，可能是通过抑制该通路减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜炎症反应和病理损伤。

综上所述，美沙拉嗪和芩柏汤均可减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜病变和炎症反应，且中、高剂量芩柏汤的效果优于美沙拉嗪，推测该方剂可能是通过抑制TLR2/IκB-α/IL-1β通路减轻炎症反应。