肝脾肾同治法重塑自噬稳态抗肝纤维化的理论探讨

刘 定，潘富珍，杨沈秋,2，张 禹,2

(1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

肝纤维化是一种损伤修复反应，其形成过程伴随肝细胞损伤，肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)激活及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的积累，病理过程具有动态演变的特点。适度的自噬是细胞抵御外界有害刺激的生理反应，而自噬稳态失衡是肝纤维化疾病进展的重要影响因素。近年来，中医药治疗肝纤维化已经积累了大量临床和实验证据，在肝纤维化的治疗中引入整体观符合其病理特征。《素问·玉机真脏论》有云：“五脏相通，移皆有次，五脏有病，则各传其所胜……肝受气于心，传之于脾，气舍于肾，至肺而死。”从“五脏相关”理论分析，肝血瘀滞、肝病传脾、脾虚湿阻、肝肾亏损为肝纤维化的基本演变规律，肝脾肾同治法为其重要的治疗方法。结合中医学“以平为期”的治疗理念，肝脾肾同治法可能通过重塑细胞自噬稳态达到抗纤维化的作用，但其作用机制尚未阐明。本文基于“五脏相关”学说，结合相关文献，就其具体理论探讨如下。

1 肝脏微循环障碍可能是肝纤维化“肝血瘀滞”的微观病理表现

肝脏微循环主要由肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)、HSCs、肝巨噬细胞、肝细胞和ECM五个部分组成，在维持肝细胞功能、调节血管张力、控制炎症、免疫反应等方面发挥着重要作用。肝脏微循环功能障碍是慢性肝病进展为肝纤维化乃至肝硬化及其主要并发症门脉高压的机制之一[1]。LSECs是一种高度特化的内皮细胞，代表着一侧的血细胞与另一侧的肝细胞和HSCs之间的界面，约占肝细胞的15%～20%[2]。LSECs具有特殊的窗孔样结构，无隔膜，直径范围为100～150 nm，缺乏基底膜，具有高度通透性[3]。在正常肝脏中，LSECs将血细胞保留在血管中，而代谢物、血浆蛋白、药物、脂蛋白和较小的病毒(<200 nm)等分子可以进入Disse空间，被肝细胞和HSCs利用[4]。此外，LSECs具有血管活性[5]、抗炎[6]和免疫功能[7]，对于肝脏维持正常的生理功能具有重要作用。LSECs主要通过肝窦毛细血管化、血管收缩、血管生成和血管分泌信号四个功能在慢性肝病的发生发展中发挥关键作用[8]。正常情况下，肝细胞和HSCs旁分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有助于LSECs维持窗孔化表型，而分化的LSECs正是维持HSCs静止表型的重要因素。在肝细胞损伤的情况下，持续的肝脏炎症驱动LSECs去分化为毛细血管表型，释放转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)激活HSCs[6，9]。激活的HSCs上调VEGF的表达，这是LSECs的一个强大的促血管生成信号。反过来，来自于LSECs的自分泌VEGF信号加重了“LSECs毛细血管化-HSCs激活-促进LSECs毛细血管化”的恶性循环，从而导致肝窦毛细血管化和纤维化形成[10]。LSECs是内皮源性一氧化氮(NO)的主要来源，NO是重要的血管张力调节剂，由内皮型一氧化氮合酶产生[11]。在正常情况下，内皮特异性转录因子Kruppel样因子2(Kruppel-like factor 2,KLF2)能诱导LSECs产生NO来响应增加的切应力，以减缓血压的增高，从而维持较低的门静脉压力[8]。在肝损伤引起氧化应激条件下，NO信号和NO对鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)的亲和力受到干扰，这导致LSECs功能障碍和肝内血管收缩[10]。生理上，肝细胞分泌的VEGF通过旁分泌机制激活VEGFR2促进LSECs增殖，调节LSECs的血管通透性，促进肝窦再生[12]。病理上，肝脏损伤引起的慢性炎症导致组织缺氧，诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控的血管生成基因的转录，从而启动病理性血管，导致肝内血管重塑和纤维化[6]。此外，LSECs还通过释放不同的血管分泌信号，调节肝脏再生和纤维化。急性损伤后，LSECs中趋化因子受体7(CXCR7)上调与CXCR4共同作用，诱导转录因子Id1，促进再生血管分泌因子，触发再生。相反，在四氯化碳诱导的慢性肝损伤导致LSECs持续激活FGFR1，抵消了CXCR7依赖的促再生反应，有利于CXCR4驱动的促纤维化血管分泌反应，从而引发肝纤维化[13]。肝巨噬细胞主要由枯否细胞(Kupffer cells,KCs)和浸润的单核/巨噬细胞组成，根据局部组织微环境的不同具有致炎或抗炎两种表型[14]。巨噬细胞是肝脏炎症过程中的关键细胞，分泌高水平的氧和氮自由基来对抗入侵的微生物以及炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL-1β)、IL-12和IL-18，从而促进先天免疫和获得性免疫[15]。但是，在损伤因素持续刺激下，功能失调的巨噬细胞促进了纤维化的发展。慢性肝损伤时，KCs和募集至肝脏的浸润巨噬细胞分泌TGF-β1和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)激活HSCs和肌成纤维细胞[16]。同时，巨噬细胞分泌的其他细胞因子如纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、IL-6以及趋化因子CCL1、CCL2、CCL22加剧了炎症和血管生成[17]。在肝损伤环境下，VEGF、胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)和PDGF是推动病理性血管生成，从而增加巨噬细胞浸润的主要分泌因子。巨噬细胞与新形成的血管共存，并分泌细胞因子、白细胞介素和生长因子激活HSCs和LSECs，同时刺激核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活性增强肌纤维细胞的存活，这些都将促进ECM积累和纤维化形成[18]。在慢性肝病进展过程中，随着肝细胞损伤，LSECs毛细血管化，肝巨噬细胞极化，HSCs活化，ECM产生和沉积引起肝脏微循环功能障碍伴随纤维化乃至肝硬化全过程。

中医藏象学说认为，肝藏血，主疏泄，以血为体，以气为用，在维持机体正常生命活动中与其他脏关系密切。《临证指南医案·卷一》指出：“肝为风木之脏……体阴用阳，其性刚，主动主升，全赖肾水以涵之，血液以濡之，肺金清肃下降之令以平之，中宫敦阜之土气以培之，则刚劲之质得为柔和之体，遂其条达畅茂之性……”若各种原因引起肝失疏泄，木气郁遏，则血脉不畅，形成血瘀。《问斋医案·卷六》有云：“肝木乃东方生发之本，宜条达不宜抑郁，郁则生发之气不振，脏腑皆失冲和……”《血证论》谓：“肝属木，木气冲和条达，不致遏郁，则血脉得畅。”肝纤维化中肝血瘀滞的形成和肝脾肾三脏功能失调密切相关。其中肝失疏泄是基础，而肝郁脾虚、脾失运化、气虚湿阻和肝病及肾、肾阳温煦失职是肝血瘀滞加重的重要病机。在肝纤维化进展过程中，肝血瘀滞伴随病程始终[19-20]。研究显示，微循环、血管内皮功能障碍是血瘀证的生物学基础[21]，而健脾活血化瘀能够下调肝纤维化进程中VEGF表达[22]，抑制LESCs毛细血管化[23]。可见，肝脏微循环障碍可能是肝纤维化“肝血瘀滞”的微观病理表现。

2 自噬稳态失衡可能是肝“疏泄失调”的微观表现

自噬是一个进化上高度保守的过程，真核细胞通过它降解有缺陷的蛋白质和细胞器，清除细胞内的病原体，以支持生物能量代谢和适应压力，保护细胞的动态平衡。大多数细胞类型中同时存在三种类型的自噬：巨型自噬、伴侣介导的自噬和微型自噬。巨型自噬也称自噬，占肝损伤细胞自噬的绝大部分，是本文主要讨论的类型。其特征是形成自噬小体，这些自噬小体起源于内质网、高尔基体、线粒体或质膜，通过关键的自噬相关蛋白将降解物质运送到溶酶体[7]。越来越多的证据表明，自噬对维持肝实质细胞(肝细胞)和非实质细胞(HSCs、LSECs、KCs)肝内稳态具有重要作用[24]。肝脏高度暴露于来自门静脉循环的异种生物和潜在炎症介质，自噬具有细胞保护和抗炎作用[25]。自噬是一个主要的细胞内循环系统，在基础条件下维持细胞内平衡，并在调节应激期间的细胞适应性反应中起着不可或缺的作用。根据细胞类型的不同，自噬在纤维化中可能有双重作用[7]。一方面，在肝细胞和LSECs中，自噬主要作为一种抗氧化和细胞保护机制发挥作用，自噬有助于维持内皮细胞表型，并在疾病早期保护LSECs免受氧化应激，以维持细胞的稳态[26-27]，在巨噬细胞和KCs细胞中，自噬的抗纤维化活性来自于抑制炎性小体NLRP3的激活和随后的促炎和促纤维化细胞因子IL-1β、IL-18的分泌[28]。另一方面，HSCs利用自噬作为脂滴降解的机制，为其活化提供能量供应[29]。在不同条件下，自噬稳态失调可促进肝损伤的进一步恶化。例如，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)患者LSECs自噬存在缺陷，这种缺陷在NASH的早期，以及在慢性肝病的晚期，都会促进肝脏炎症和纤维化[30]。此外，酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)患者肝脏中miR-155含量增加，影响自噬途径中的多个基因，在溶酶体水平损害ALD的自噬通量，加重细胞损伤[31]。而在CCl4诱导的肝损伤和纤维化中，自噬和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)显著增加，未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)试图通过刺激自噬来克服错误折叠的蛋白质和细胞器造成的危害。如果UPR介导的自噬不能提供细胞内的稳态，就会触发细胞凋亡，因此ERS细胞的命运取决于UPR和自噬之间的平衡[32]。最近的研究表明，在应激源作用下，应激蛋白TRIB3上调，直接与自噬受体SQSTM1/p62相互作用，并干扰其与MAP1LC3/LC3和泛素化底物蛋白的结合，从而抑制自噬通量。一旦自噬受损，称为多泡小体(multivesicular bodies,MVBs)的特定内含体不再被引导到自噬途径，而是与质膜融合，促进了富含INHBA/Activin A的外泌体分泌，而其正是TGF-β家族成员之一，从而导致HSCs的迁移、增殖和活化[33]。因此自噬稳态失衡在肝纤维化进展中具有重要作用。但是，直接以自噬为靶点治疗肝纤维化的小分子药物目前还缺乏针对特定类型肝细胞的载体以及如何确定给药剂量、疗程和频率，以避免在机体中产生限制或诱发自噬相关的不良反应，这增加了特异细胞选择性靶向药物的开发成本和难度。

从中医藏象学说分析，肝主疏泄是肝的基本生理功能。《素问·五常政大论篇》曰：“发生之纪，是谓启陈，土疏泄，苍气达，阳和布化，阴气乃随，生气淳化，万物以荣……”说明疏泄是肝气条达的具体表现。《素问·宝命全形论篇》曰：“土得木而达。”人体的气、血、津液、精神都必须在肝脏疏泄功能正常的条件下才能发挥各自应有的作用。肝疏泄功能正常则气机调畅，气血和调，脏腑器官的生理活动就能保持协调。沈金鳌在《杂病源流犀烛·肝病源流》说：“肝和则生气，发育万物，为诸脏之生化……”若肝疏泄功能失调，可影响气、血、津液的运行，造成“痰”“湿”“浊”“瘀”等病理产物停留。结合肝脏自噬的生理功能特点，自噬失调引起的受损细胞器堆积与肝“疏泄失调”引起的内生病理产物相似。在肝细胞、LSECs、KCs中自噬作为维持细胞稳态的重要过程，适度自噬可以合理利用溶酶体降解自身受损细胞器，产生再次被细胞所利用的物质和能量，同时抑制炎性小体的产生及分泌，协助机体顺利度过缺氧、饥饿等应激状态，从而限制肝脏损伤发展，自噬过度激活或抑制则引起肝损伤加重。在活化的HSCs中脂噬过度激活引起脂滴降解为其增殖分化提供能量，同时对细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的自噬受抑制导致纤维性EVs释放，导致肝纤维化进展[34]。实验研究发现，抑郁模型大鼠存在自噬过度激活，引起海马神经元损伤，而调肝法可以调节大鼠海马组织自噬发挥抗抑郁作用[35]。柴胡疏肝散可以抑制胃Cajal间质细胞过度自噬，进而促进功能性消化不良大鼠胃动力[36]。 柴胡皂苷A与芍药苷联用能提高经皮质酮处理的慢性心理应激损伤模型PC12细胞自噬活性[34]。因此自噬稳态失衡可能是肝“疏泄失调”的微观表现。

3 肝脾肾同治法重塑细胞自噬稳态是治疗肝纤维化的重要方法

肝纤维化属中医“胁痛”“臌胀”“癥瘕”“积聚”“肝积”等疾病范畴。病程中“肝血瘀滞”是病理基础，而肝“疏泄失调”是重要病机。从“五脏相关”理论来看，肝失疏泄，肝郁脾虚，气虚湿阻，肝病及肾，肝肾虚损是肝纤维疾病病机变化特点，肝脾肾同治是治疗肝纤维化的基本方法。研究表明，健脾化痰法能提高线粒体自噬水平，对高脂饮食诱导的大鼠NASH模型具有防治作用[37]。补肾填精法能提高海马神经元自噬水平[38]，对乙肝肝硬化代偿期具有一定治疗作用[39]。海马线粒体自噬减退与脾气虚发生有关，益气健脾活血法能降低心肌细胞炎症反应、调节线粒体自噬[40-42]。通过网络药理学及数据挖掘研究显示，干预自噬的中药以清热、补益为主[43]。前期临床研究也显示肝脾肾同治法具有防治肝纤维化、肝硬化作用[44-47]，因此肝脾肾同治法改善肝脏微循环，重塑自噬稳态是治疗肝纤维化的重要方法。

4 小 结

肝纤维化是慢性肝病进展为肝硬化的必经阶段，目前仍然是世界范围内的公共卫生问题。肝纤维化形成机制十分复杂，涉及多种细胞表型转换和分子间的平衡失调，单一阻断某一信号通路的药物不能排除其他代偿或负反馈机制的影响，这也是长期以来肝纤维化缺乏明确临床用药的原因之一。同时，由于自噬在不同的细胞表型中具有双重作用，这增加了选择性抑制剂的开发难度，如何利用这些复杂的信号机制来促进适应性组织修复和动态平衡是今后研究要解决的问题。中医药因“整体观”和“辨证论治”在肝纤维化的治疗中具有优势，但尚缺少中医药干预对自噬及其相关信号在肝纤维化中的适应性改变方面的实验依据。基于肝纤维化中肝脏微循环改变和“肝血瘀滞”及自噬稳态失衡和肝“疏泄失调”的密切联系，结合肝纤维化病程中肝脾肾功能失调的中医病机特点及“以平为期”的中医治疗思想，课题组下一步将进一步通过动物实验明确肝脾肾同治法干预对肝纤维化中细胞自噬的调节作用，同时通过蛋白质组学及生物信息学研究中医“以平为期”治疗理念在肝纤维化中促适应性组织修复作用的微观物质基础，以期阐明肝脾肾同治法重塑细胞自噬稳态抗肝纤维化的分子机制。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。