肿瘤干细胞与肺腺癌EGFR-TKI 获得性耐药机制的研究进展

陈 雨 陈 杰 李亚军▲

1.遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院肿瘤科，贵州遵义 563000；2.遵义医科大学第三附属医院 遵义市第一人民医院泌尿外科，贵州遵义 563000

肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，也是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤，绝大部分为非小细胞肺癌，非小细胞肺癌又可分为大细胞癌、鳞状细胞癌和腺癌，其中腺癌以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变率在肺癌患者中占比最高，约占50.2%[1]。在临床中，尤其是中晚期EGFR突变的肺腺癌患者，分子靶向治疗是其主要的方法[2]。表皮生长因子受体激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）是针对EGFR 突变的肺腺癌患者临床常用的靶向药物，包括吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等。然而，绝大多数EGFR 突变的肺腺癌患者在靶向治疗1～2 年出现耐药，继而肿瘤进展、复发，影响了肺腺癌患者的整体治疗效果[3]。肺腺癌EGFR-TKI 耐药，是目前研究较多，进展较快的一类靶向药，其中最著名并且获得广泛认可的机制是T790M 突变，约占获得性耐药机制的60%，其余的耐药机制包括c-Met 扩增、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、向小细胞肺癌的转化等，对EGFR-TKI 的内在抗性和其他获得性耐药机制还不完全清楚[2,4-5]。

近年来，随着肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）研究的进展，有研究学者认为，肺癌靶向治疗中耐药的产生可能是由于CSC 的存在。CSC 不同于一般的肿瘤细胞，其具有较强的自我更新和分化的能力，在肿瘤形成、进展、转移及耐药等方面起着重要的作用。因此，有研究学者提出CSC 与肺腺癌EGFR-TKI 获得性耐药机制有一定关系，也成为当前克服耐药的关键及目前的研究热点[6]。因此本文主要综述近年来CSC与肺腺癌EGFR-TKI 获得性耐药机制的相关性的研究进展。

1 肺癌干性标志物调控肺癌干细胞干性介导EGFRTKI 耐药

CSC 理论的出现，从新的视角为肺癌发生及复发提供了合理的解释，该理论认为肺癌存在CSC，CSC是肿瘤细胞的一小部分，其具有自我更新、无限增殖和分化潜能的能力，且具有促进肿瘤生长、复发、转移及放化疗抵抗的作用[7]。研究证明，CSC 可以表达多种干性标志物，如CD133、乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）、ABC 转运蛋白等[8]。近年来，研究发现肺癌干细胞与肺腺癌EGFR-TKI 耐药存在着一定关系[9]。进一步研究显示肺癌干细胞标志物通过调控肺癌干细胞干性进而与肺腺癌EGFR-TKI 耐药有关，主要进展如下：

1.1 CD133

CD133 是Prominin 细胞表面蛋白家族成员之一，是一个含5 次跨膜结构的分子量为120 kb 的糖蛋白。CD133 广泛存在于多种CSC 中，目前在肝癌、结肠癌、肺癌中被证实为CSC 标志物，其阳性表达率与肿瘤恶性程度密切相关[10]。据研究显示，源自肺腺癌细胞系的耐药细胞富含CD133 阳性细胞，并显示出更高水平的血管生成因子，从而导致CSC 的致瘤和转移潜力增加[11]。Shao 等[12]研究发现，在肺腺癌一代EGFR-TKI 埃克替尼耐药细胞株，其干细胞标志物CD133 高表达，并且更能有效形成球体。近期研究报道[13-14]肺腺癌一代EGFR-TKI 耐药细胞株呈现CSC表型具有干性，包括集落形成、增殖能力增强及干细胞标志物CD133 水平升高；此外，可能干细胞标志物Oct-4 通过调节具有EGFR 突变的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞系中的CSC特性来诱导吉非替尼耐药。除此之外，某些蛋白的变化也会影响EGFR-TKI 耐药性，F-盒/WD 重复蛋白7（FBXW7），与细胞静止状态有关，敲除FBXW7 基因可显著减少肺癌吉非替尼耐药细胞中CD133 阳性CSC 数量，从而提高吉非替尼的敏感性[15]。

1.2 ALDH

ALDH 是细胞内解毒酶的一个家族，能够调节基因表达、细胞解毒和分化，并且在几种肿瘤的耐药性发展中具有重要作用，也是肺癌干细胞的重要标志物[16]。从NCI-H358 和NCI-H125 肺癌细胞株中分离出来的ALDH 阳性细胞富含致癌CD133 阳性的肿瘤细胞[17]。也有相关报道ALDH1 蛋白的高表达与NSCLC患者的预后差和化疗药物耐药有关[18]。同样，Huang等[16]探讨了CSC 中ALDH1A1 表达与EGFR-TKI 耐药性的关系，证明PC-9 肺癌细胞ALDH1A1 高表达对吉非替尼具有耐药性。肺癌EGFR-TKIs 靶向治疗还被证明可诱导ALDH 的过度表达、CSC 干性基因的增加（Nanog、Oct-4、Sox-2），并赋予其对EGFR-TKI治疗的耐药性[9]。近期发现全反式维甲酸通过影响干细胞标志物ALDH1 的活性抑制吉非替尼诱导的CSC的富集，从而进一步提高肺癌细胞毒性[19]。

1.3 ABC 转运蛋白

ABC 转运蛋白即ATP 结合式转运蛋白，是一种能利用ATP 水解产生的能量对不同底物进行跨膜运输的蛋白质。这种蛋白质一般位于细胞膜上，保护细胞免受有害毒素和异物的伤害[20]。ABC 转运体包括ABCG2、ABCB1、ABCC1 等，其中ABCG2 转运阿霉素、甲氨蝶呤等化疗药物，而ABCB1 在一半以上的化疗耐药肿瘤中都可见其表达[21-22]。并且有研究证实EGFRTKIs 与该转运蛋白相互作用[23]。在肺癌患者的原发性肿瘤中，研究表明其过表达与NSCLC 中CSC 介导的耐药性直接相关[24]。Chen 等[25]研究表明，在野生型EGFR 表达肺癌细胞中吉非替尼的耐药性与ABCG2 的表达增加有关，并且与肺癌患者中吉非替尼的不良反应也有关。同样阿法替尼耐药的细胞系HCC827-ACR 也表现出ABCB1 的过表达，提示ABC 转运蛋白与阿法替尼的获得性耐药密切相关[13]。因此，ABC蛋白作为CSC 的表面标记可以用来识别CSC，并且其本身转运药物的能力使得CSC 能够对抗化疗药物的侵袭。

2 miRNA 调控肺癌干细胞干性介导EGFR-TKI 耐药

miRNAs 是一类由内源基因编码的长度为22～26个核苷酸的非编码小分子RNA，参与转录后基因的表达调控。其异常表达、突变会导致蛋白水平表达异常，继而通过影响相关的细胞信号通路改变肿瘤细胞对药物的敏感性。研究发现，miRNA 与多种肿瘤耐药相关，尤其是肺癌，并且可以影响肿瘤细胞对吉非替尼等药物敏感性，参与EGFR-TKIs 耐药[26]。此外，近年来研究表明，微RNA（miRNA）能够通过调节转录因子和下游信号通路控制CSC 的生长和分裂，进而影响CSC 的自我更新与分化[27]。进一步研究显示miRNA通过调控肺癌干细胞干性进而与肺癌EGFR-TKI 耐药有关[27]。主要进展如下：

Wang 等[28]鉴定EGFR 突变晚期肺癌一代EGFRTKI 耐药患者血浆中的miRNA 基因，发现一代EGFRTKI 治疗下EGFR19 缺失的20 例NSCLC 患者中具有较高表达水平的miR-21、miR-34a 和miR-218。进一步发现，miR-223、miR-214 一起通过激活IGF1R/PI3K/AKT 和ERK 信号通路产生吉非替尼和厄洛替尼耐药性[29-30]。EGFR-TKI 在NSCLC 中的更强功效归因于miR-200c 过表达，这些患者能够通过PI3K/AKT 和MEK/ERK途径对EMT 的调节来恢复吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼的敏感性，且miR-200c 过表达与更高的疾病控制率，更长的无进展生存期和总生存期相关[13,31-32]。此外，大量证据证实miRNA 对CSC 干性的维持、自我更新及分化的调节至关重要[27]。进一步认为miRNA 可通过直接调节CSC 诱导的NSCLC进展和对耐药的各个靶标而发挥重要的功能作用[27]。研究发现miR-124a 及miR-122 分别通过靶向泛素特异性蛋白酶14（USP14）及Prx Ⅱ过氧化物酶（Prxs）抑制肺癌干细胞的生长和自我更新，促进其凋亡进而增强吉非替尼敏感性[33-34]。研究发现miR-128 可以通过减少CSC 种群数来逆转耐药性并增强吉非替尼对NSCLC的抗肿瘤作用，并与c-met/PI3K/AKT 途径有关[35]。同样，研究发现miR-127 通过促进肿瘤细胞经历EMT 过程并获得肺癌干细胞自我更新及干性基因表达的上调，从而提高吉非替尼敏感性，这一特性与激活了Akt/ ERK 凋亡途径相关[36]。进一步在非小细胞肺癌中发现，let-7 的下调和miR-17 的上调通过调节NSCLC 细胞的自我更新能力影响肺癌干细胞样特征从而促进了对吉非替尼的耐药[37]。综上，miRNA 主要是通过控制相关信号通路的激活来实现对CSC 的调控，这使得CSC 能够维持其干样特性并对抗化疗药物的毒性作用。

3 植物化合物调控肺癌干细胞干性介导EGFR-TKI耐药

目前一些研究表明，植物化合物可以有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，使肿瘤细胞增敏并增强治疗功效[38]。进一步发现植物化合物通过调节肺癌干细胞干性进而与EGFR-TKI 耐药有关，主要进展如下：

扶正解毒方药，由党参、黄芪、沙参等组成，研究发现CD133 阳性小鼠接种部位的肿瘤体积较普通肺癌细胞的肿瘤体积更大，且发生耐药时间更短，然而在扶正解毒方药治疗下CD133 阳性小鼠接种部位的体积明显更小，发生耐药的时间最晚。暗示中药能够抑制肺癌干细胞的生长逆转吉非替尼获得耐药[39]。具有抗癌能力的天然植物β-榄香烯，研究发现吉非替尼联合榄香烯可抑制肺癌干细胞的干性包括自我更新能力，干性相关基因表达下降从而提高吉非替尼的敏感性，其与依赖EZH2 甲基转移酶的致癌途径有关[40]。BRM270 是从天然植物中提取的配方，由柑桔、芦荟等组成。研究发现BRM270 诱导化学耐药的NSCLC细胞凋亡从而抑制细胞增殖，进一步发现BRM270 能够通过影响EMT 来抑制吉非替尼靶向耐药的CSC，从而增强吉非替尼的敏感性[41]。硫磺酸存在于十字花类蔬菜中，已被证明能抑制各类癌细胞的恶性生长。用递增浓度的硫磺酸联合吉非替尼处理肺腺癌PC9耐药细胞时发现，硫磺酸可显著抑制肺癌干细胞标志物CD133 和CD44 的表达从而逆转吉非替尼耐药性，进一步发现，硫磺酸可能通过下调CSC 依赖的SHh途径从而抑制肺癌干细胞干性增强吉非替尼的细胞毒性[42]。

4 小结与展望

综上所述，可以发现这几种分子机制的一个共同点就是对CSC 干样特性维持的作用，这种作用是CSC 能够对抗EGFR-TKI 类靶向药物毒性作用的基础。通过对CSC 耐药机制的研究可以探索新的靶向目标，改善EGFR-TKI 向耐药。例如，在EGFR-TKI靶向药物的基础上增加CSC 的靶向治疗，通过这种联合治疗方案能够同时清除肿瘤细胞和CSC，提高肿瘤患者靶向治疗的整体效果，具有很好的前景。尽管CSC 在耐药性中的作用是一个热门且新兴的话题，但目前其尚缺乏深入的临床应用。未来对肿瘤和CSC生物学的更深入了解将促进对肿瘤进程和对靶向治疗耐药的新的机制的理解，随着这一高度活跃领域的发展，NSCLC 患者的临床结局有望得到改善。