2021年新疆部分地区猪伪狂犬病病毒gB、gE蛋白抗体检测及分析

邱正青，李彦芳，邱国斌，陈朝阳，屈勇刚

（1.石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.新疆兵团第四师畜牧兽医工作站，新疆 可克达拉 835216）

猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的猪的一种急性、热性传染病，被世界动物卫生组织（OIE）纳入必须报告的动物疫病，2022年被我国列为三类动物疫病。此病在世界范围内流行，随着养猪业不断发展，该病给我国养猪业造成一定的经济损失[1]。目前，我国采用净化结合基因缺失苗免疫防控，使得该病的流行趋势有所缓和，但该病的潜伏感染情况比较普遍，做好猪场PR血清学检测，及时清除隐性带毒猪，净化猪群至关重要。科研工作者们建立了PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断方法，使用相应的ELISA（酶联免疫吸附试验）检测方法分别检测PRV-gE蛋白和PRV-gB蛋白抗体来监测猪群PRV野毒感染情况和疫苗免疫效果，大量试验结果证实了此方法具有简单、快捷、灵敏性强和特异性高等优点[2-3]。

为了解新疆部分地区2021年猪群PRV野毒感染情况和疫苗免疫效果，本试验对来自新疆5个地区的9个规模化猪场的580份血清样品分别进行了PRV-gE和PRV-gB抗体检测及分析，以期为新疆地区的PR防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 血样来源 2021年1—12月，从新疆石河子、阿克苏、伊犁、克拉玛依、乌鲁木齐5个地区的9个规模化猪场随机采集生猪血液，分离血清，共计采集580份血清样品。

1.1.2 试验仪器与材料 猪伪狂犬病病毒gB（PRV-gB）ELISA检测试剂盒和猪伪狂犬病病毒gE（PRV-gE）ELISA检测试剂盒均购自北京爱德士元亨生物科技有限公司；微量移液器购自德国Eppendorf公司、自动酶标仪购自美国Bio Tek仪器有限公司；一次性兽用采血器购自广州金默生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 对待检猪只的前腔静脉部位进行消毒，使用一次性兽用采血器刺入前腔静脉采集全血，3～5 mL/头。室温静置2～3 h，待血清析出后，移至无菌EP管中，3 000 r/min离心10 min，立即进行ELISA检测，或放置-20 ℃保存备用。

1.2.2 检测方法 根据PRV gB、gE蛋白ELISA检测试剂盒说明书进行操作。试验前，所有试剂需恢复至室温，使用前轻微震荡混匀。

室温下，先用稀释液将待检血清、阳性对照和阴性对照进行2倍稀释处理，再分别取100 μL稀释好的待检血清和阴性对照、阳性对照加入抗原包被板的微孔中，室温孵育60 min；用洗涤液洗板3～5次后，拍干各孔残留的洗涤液，每孔加入100 μL酶标抗体，室温孵育20 min；再次洗板3～5次，拍干后，每孔加入100 μL的TMB溶液，室温避光显色15 min后，加入50 μL终止液终止反应。将酶标板置于酶标仪中，测定各反应孔中的OD650nm值，记录并保存数据。

1.2.3 判定结果的标准 判定本试验成立的条件是：NCX-PCX≥0.30，否则结果不成立。当S/N＞0.70时，样品判定为阴性；当S/N≤0.60时，样品判定为阳性；当0.6＜S/N≤0.70时，样品判定为可疑。其中S为各样品OD650nm值。其中，NCX、PCX分别为阴性对照孔和阳性对照孔OD650nm值的平均数；S为各待检样品OD650nm值。

1.2.4 统计分析 用SPSS软件对试验数据的统计学分析，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 不同地区猪群中PRV-gE抗体检测情况

5个地区的580份血清样品中，PRV-gE抗体阳性样品有164份，平均阳性率为28.28%（164/580）。其中，克拉玛依地区PRV-gE抗体阳性率最高，为74.29%（26/35）；阿克苏地区PRV-gE抗体阳性率最低，为18.03%（53/294）。5个地区的平均S/N值为0.76。其中，克拉玛依地区的平均S/N值最小，为0.34；阿克苏地区的平均S/N值最大，为0.89。克拉玛依地区与其余4个地区之间的PRV-gE抗体水平均存在显著差异（P<0.05），结果见表1。

表1 新疆不同地区PRV-gE蛋白抗体检测结果

2.2 不同规模化猪场PRV-gE蛋白抗体检测情况

9个规模化猪场（A～I）PRV-gE平均阳性率为28.28%（164/580）。其中，F场PRV-gE抗体阳性率最高，为74.29%（26/35）；B场和H场PRV-gE抗体阳性率最低，均为0。9个规模化猪场平均S/N值为0.76。其中，F场的平均S/N值最小，为0.34；B场的平均S/N值最大，为0.97。F场与其余8个猪场之间的PRV-gE抗体水平均存在显著差异（P<0.05），结果见表2。

表2 不同规模化猪场PRV-gE蛋白抗体检测结果

2.3 不同地区猪群PRV免疫抗体检测情况

PRV野毒感染和gE基因缺失苗免疫的猪只均可以产生抗gB蛋白的抗体，因此，要准确评估PRV的疫苗免疫效果，应当剔除PRV野毒感染产生的抗gB蛋白抗体数据。在5个地区的580份血清样品中，PRV免疫抗体阳性样品有359份，平均免疫抗体阳性率为61.9%（359/580），低于国家规定标准（70%）。5个地区的PRV免疫抗体阳性率均未达到国家规定标准。各个地区的PRV免疫抗体阳性率差异较大，其中，阿克苏地区的PRV免疫抗体阳性率最高，为67.35%（198/294）；克拉玛依地区的PRV免疫抗体阳性率最低，为8.57%（3/35），结果见表3。

表3 不同地区PRV免疫抗体检测结果

2.4 不同规模化猪场PRV免疫抗体检测情况

9个规模化猪场（A～I）的PRV免疫抗体阳性样品有359份，平均免疫抗体阳性率为61.90%（359/580）。在9个被调查猪场中，只有22.22%（2/9）猪场的免疫抗体阳性率达到国家规定标准。各个猪场的PRV免疫抗体阳性率差异较大，其中，H场PRV免疫抗体阳性率最高，为100.00%（13/13）；F场PRV免疫抗体阳性率最低，为8.57%（3/35），结果见表4。

表4 不同规模猪场PRV免疫抗体检测结果

3 讨论与分析

3.1 新疆地区猪群PRV-gE抗体结果分析

PR是一种急性、烈性传染病，也是威胁我国规模化猪场主要疫病之一，能够导致妊娠母猪流产或产死胎[4]。我国的规模化猪场均使用PRV-gE基因缺失苗进行免疫接种，在大多数情况下，PRV-gE抗体阳性的猪只为PRV野毒感染。本试验对2021年新疆5个地区的猪群进行了PRV-gE抗体检测，其抗体平均阳性率为28.28%。张鲁安[5]和魏其等[6]分别对2005年、2018年北疆地区猪群PRV-gE抗体进行检测发现，其抗体阳性率分别为10.1%和45.14%。齐向涛[7]、刘鸽等[8]和李静等[2]分别对2014年、2016年和2019年新疆地区猪群PRV-gE抗体进行检测发现，其抗体阳性率分别为27.8%、14.91%和44.67%。以上研究表明，新疆部分地区PRV野毒感染率存在波动，但形势仍较为严重。

3.2 新疆地区猪群PRV免疫抗体结果分析

囊膜糖蛋白gB是PRV复制必需的糖蛋白，不管是活疫苗免疫接种还是野毒感染都会刺激机体产生抗PRV-gB抗体。只有在排除野毒感染的情况下，gB抗体才代表的是疫苗免疫产生的抗体。因此，要准确评估PRV的疫苗免疫效果，应当去除PRV野毒感染产生的抗gB蛋白抗体数据。对本试验结果进行分析发现，2021年新疆部分地区猪场的PRV平均免疫抗体阳性率为61.9%，低于国家规定标准。5个地区的PRV免疫抗体阳性率均未达到国家规定标准，仅有22.22%猪场的PRV免疫抗体阳性率高于国家规定标准，各地区和各猪场间的PRV免疫抗体阳性率差异较大。

4 结论

PR防控工作中，高效的基因缺失疫苗的推广及PRV野毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断方法的联合使用是PR防制的基础[9]。本研究表明，2021年PRV在新疆部分地区仍然流行，形势不容乐观。新疆部分地区规模化猪场平均免疫抗体阳性率未达到国家标准，只有22.22%（2/9）猪场的免疫抗体阳性率达到国家规定标准。不同地区之间、各猪场之间PR防控水平层次不一。提示新疆部分地区规模化猪场应在加强PR免疫防控的基础上，做好PR的综合防控工作。