一例猪乙脑病毒感染引起母猪繁殖障碍的诊断与防控

王福厚，李风云，朱志芳，葛生虎

（1.甘肃畜牧工程职业技术学院，甘肃 武威 733006；2.临西县农业农村局，河北 邢台 054900；3.邢台市农业农村局，河北 邢台 054000；4.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000）

猪乙脑病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）为黄病毒科、黄病毒属重要成员，属于单股正链RNA病毒。JEV可感染多种动物，其中包括猪、蚊子、犬、兔和马等，对我国畜禽养殖业健康发展造成巨大的威胁[1]。此外，JEV可感染人，该病原的流行严重威胁东南亚和西太平洋等地区居民健康，每年近300万人生活在JEV流行地区，且具有高度感染风险[2]。大部分人感染JEV不会表现严重的临床症状，但少部分人会出现急性脑炎，且病死率较高（20%～30%）。JEV感染猪群后可导致母猪出现繁殖障碍、公猪睾丸炎和仔猪神经障碍等，且JEV可在猪场形成“猪-蚊-人”传播模式，因此在猪场开展灭蚊灭鼠工作对JEV的防控极为重要。

近年来，随着猪乙脑弱毒疫苗的广泛应用，同时猪场生物安全水平提高减少了蚊虫滋生几率，国内猪场发生JEV暴发或流行很少见。值得注意的是，蚊子在JEV的传播过程中发挥重要作用，但蚊虫一般在夏季和秋季滋生，而部分猪场忽视JEV的流行和危害，在夏季和秋季未对猪群免疫接种JEV疫苗，这无疑对猪群和猪场工作人员健康会造成巨大的威胁。为此，笔者分享一起2022年10月初接诊的一例由JEV感染引起母猪繁殖障碍的诊断与防控案例，旨在提高猪场工作人员对该病的防控意识，促进当地养猪业的健康发展。

1 猪场发病情况

山东省莘县某小型猪场饲养繁殖母猪100余头。猪场负责人王某表示，母猪群于2022年6—7月配种，至10月初已有40余头母猪产仔，其中20头繁殖母猪死胎率较高（图1左），个别母猪产木乃伊胎。母猪无明显临床症状，但其所产胎盘发红，剖检死胎可见脑水肿且积液多，甚至液化；肾脏出血、脾脏和肝脏肿大等，且淋巴结出血（图1右）。

图1 繁殖母猪流产死胎（左）与死胎剖检（右）

咨询猪场负责人得知，该场发病前已对猪群普免猪伪狂犬病弱毒疫苗、猪瘟疫苗（亚单位疫苗）、猪口蹄疫疫苗、猪细小病毒疫苗等。且少数母猪出现繁殖障碍后对所有猪群紧急免疫猪蓝耳病弱毒疫苗和抗生素治疗，但效果不佳。

2 实验室诊断结果

为确诊发病原因，猪场负责人将2头流产胎儿低温送至河北铭诸生物科技有限公司进行病原诊断。无菌采集流产胎儿脑组织、肾脏、淋巴结、肺脏、肝脏和脐带血等样品。超净工作台下用灭菌刀和眼科剪取少量淋巴结、脑组织、肺脏和脐带血等置于灭菌研钵内。加入少量无菌生理盐水，研磨后用无菌纱布过滤，取上清液用于后续细菌分离鉴定和病毒的分子鉴定。

2.1 细菌分离鉴定结果

在无菌环境下，用火焰灼烧过的接种环蘸取少量上清液在鲜血固体琼脂培养基表面划线，其后将平板倒置于37 ℃恒温箱内培养16～24 h，观察平板表面是否长出疑似菌落。结果未在平板上发现疑似菌落，说明该场母猪出现繁殖障碍不是细菌性病原感染引起。

2.2 病毒性病原诊断结果

采用商业化DNA/RNA提取试剂盒提取上清液基因组（DNA与RNA混合物），其后采用cDNA反转录试剂盒将基因组中RNA逆转录为cDNA。操作流程均参考试剂盒说明书，将获得的cDNA基因组保存于-20 ℃，待检。

以cDNA或DNA基因组为模板，使用商业化实时荧光定量PCR试剂盒分别检测基因组中是否存在猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和猪乙脑病毒（JEV）核酸。结果发现，3份样品中均未检测到PCV2、CSFV、PRRSV、PRV和PPV核酸，这3份样品JEV核酸检测对应Ct值分别为30.233、24.684和26.707。根据试剂盒提供说明书，样品Ct值≤35则可判定为阳性，因此可判定3份样品均为JEV核酸阳性。

综合病猪发病情况和实验室诊断结果，笔者判定该场母猪出现繁殖障碍类疾病是由JEV感染引起。

2.3 JEV阳性样品E基因序列扩增与分析

当前，全世界JEV流行株可分为5种基因型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型），国内存在Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅴ型3种基因型JEV毒株，其中Ⅰ型为主要流行株[3]。为确定该猪场流行JEV毒株基因型，应猪场负责人要求，笔者采用RT-PCR法扩增1份Ct值为24.684的JEV阳性样品E基因序列。引物序列为：JEV-E-F：5'-TTAACTGTCTGGGAATGGG-3'；JEV-E-R：5'-GGCATGCACATTGTCGCTAA-3'，RT-PCR产物大小约1 500 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。RT-PCR体系（25.0 μL）包括2×PCR预混液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2.0 μL及无RNA酶水9.5 μL；反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共设置35个循环；72 ℃ 7 min。RT-PCR反应结束后取阳性产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序。

结果如图2所示，扩增获得JEV E基因序列RT-PCR产物大小约1 500 bp，与阳性对照一致，阴性对照未扩充出目的片段，说明我们成功扩增出JEV E基因片段。进一步测序结果表明：本试验扩增获得序列大小为1 497 bp，可编码499个氨基酸。与GenBank收录的不同基因型JEV毒株进行同源性比较，该分离株E基因与GⅠ-b亚型毒株核苷酸序列相似性最高（为99.9%），与其它基因型毒株对应序列同源性较低，均低于95.3%；且与目前广泛使用的JEV疫苗株（GⅢ型）E基因序列同源性仅87.9%，提示该场暴发的JEV流行株属于GⅠ-b亚型（图3）。

图2 JEV阳性样品E基因序列RT-PCR扩增产物凝胶电泳

图3 JEV阳性样品（SD-LX-1）E基因核苷酸序列与参考毒株同源性比对结果

3 讨论

流行性乙型脑炎又称为日本脑炎，是由日本乙型脑炎病毒（JEV）感染引起的一种人畜共患性疾病。JEV属于重要的虫媒病毒，能够感染猪、人和蚊虫等多种动物和昆虫。JEV可在猪场中以“猪-蚊-人”为闭环形式流行，给猪群和猪场工作人员健康造成巨大的威胁。2013年，山东省部分地区曾暴发乙型脑炎疫情，且当前有研究表明JEV仍广泛流行于山东省部分地区[4]。蚊虫对JEV的流行极为重要，因此JEV在猪场暴发时期多为夏季和秋季，故猪场在夏季和秋季对猪群免疫接种JEV疫苗对该病的防控十分重要。

然而，相较于其它病毒性疾病（如肠道病毒引起腹泻和PRRSV、PCV2等病原感染引起繁殖障碍）而言，JEV感染所致母猪繁殖障碍相关案例很少，这导致养殖企业（户）经常忽视对JEV的防控。若JEV流行区域的猪场在夏季和秋季未对猪群免疫接种JEV疫苗，猪群受JEV感染威胁则很大，继而会造成巨大的经济损失。2022年10月初，山东莘县某小型猪场发生疫情，结合临床症状观察和实验室诊断结果最终判定该猪场母猪发生繁殖障碍疾病是由JEV感染引起。结合该场对猪群免疫程序信息，我们判定该场暴发JEV可能是未及时对猪群免疫JEV疫苗所致。进一步扩增并分析该猪场JEV阳性样品E基因序列，发现该毒株与GⅠ-b型JEV参考株同源性最高，说明该猪场流行JEV GⅠ-b型毒株。

目前暂无针对乙型脑炎有效的治疗药物，因此在临床上主要依靠疫苗免疫对该病进行防控。为此，笔者建议该场采取以下措施：1）淘汰出现睾丸炎等症状的公猪；淘汰母猪全窝弱仔或木乃伊胎；2）提高猪场生物安全水平，采用物理和化学方法进行灭蚊；及时清理污水和积水等，或在污水（积水）中撒杀灭蚊虫药物；3）对所有猪群紧急免疫接种JEV弱毒疫苗（SA14-14-2），免疫后期应检测猪群抗体水平，根据检测结果调整免疫程序；同时定期采集疑似出现繁殖障碍母猪或流产胎儿组织样品，送至专业的诊断实验室进行病原检测，根据检测结果及时淘汰感染JEV猪群，以期净化该病；4）给予猪群营养丰富的全价饲料，在饲粮中添加黄芪多糖等可提高猪群免疫力的中草药。