苗药小花清风藤叶内生真菌Guignardia sp.次生代谢产物化学成分的分离和结构鉴定

李 婷，周永强，徐 慧，魏紫云，任佳霖，赵春丽*

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

小花清风藤Sabia parviflora Wall.exRoxb 为清风藤科清风藤属的常绿木本藤本植物[1]，入药部位包括根、茎、叶具有治疗风湿性关节痛，腰痛，止血、止痛的作用。小花清风藤主要含黄酮类、生物碱、五环三萜、挥发性等成分[2-7]。已有的研究结果表明，长期的协同进化，使某些药用植物内生真菌可以产生与宿主植物相同或相似的活性物质[8]。且不会引起宿主植物出现明显感染症状。内生真菌除了具有间接或直接，协同或拮抗宿主植物个体合成有机化学物质能力，还能自身合成具有活性的化合物。目前，学者们的研究方向仍停留在小花清风藤的化学成分、药理作用、临床作用层面，对于其内生真菌的深入研究暂未报道。因此，从已发现的苗药小花清风藤内生真菌Guignardia sp.（球座菌）活化后进行大批量发酵，并采用溶剂萃取法、柱色谱法等制备有效部位，进一步结合柱色谱的方法纯化并结构解析单体化合物。对小花清风藤内生真菌进一步的开发利用，筛选活性物质，对保护维护小花清风藤生态环境与利用具有一定的科学意义。依托贵州中医药大学对小花清风藤内生真菌进行分离，在小花清风藤叶中分离出一株球座菌并命名为L-53。现有相关研究表明，球座菌代谢产生的Meroterpenes、Dioxolanone 及它们的化学合成衍生物具有较好的抗真菌活性。裙带菜中的球座菌能够产生麦角甾醇类化合物[9]为更好地合理利用小花清风藤内生真菌资源，本文对Guignardia sp. 次生代谢产物进行了分离提取与结构确证。

1 实验部分

1.1 实验材料

小花清风藤内生真菌菌株L-53 是从小花清风藤叶中分离得到，经鉴定为Guignardia sp.（球座菌属），现保存于贵州中医药大学中医药大学生物制药实验室。

1.2 实验仪器与试剂

甲醇、二氯甲烷、石油醚（天津市富宇精细化工有限公司），80-100 目/200-300 目柱层析硅胶（青岛海洋化工有限公司）；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FA2104N 型电子天平（上海菁海仪器有限公司），DHG-9070B 智能型恒温鼓风干燥箱（上海琅轩实验设备有限公司）；SB-600DTY 超声波多频清洗剂（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DLSB-5L/20 低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；N-1300 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司），UPTC-20 超纯水机（闵测仪器设备有限公司），RE-5210A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），HP-05 陶瓷封闭式恒温电烤炉（上海学森仪器有限公司），DCD-642WEG 型冰箱（安徽康佳同创电器有限公司），01-5A 型烘干箱（杭州蓝天仪器厂），18L 高压灭菌锅（贵阳凯信商贸经营部），Gilson 移液枪（吉而逊实验仪器（上海）有限公司），LRH 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 培养基的制备及发酵菌种的活化

取4.01 g 铃薯葡萄糖琼脂（PDA）粉末加入100 ml 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后放入超净台紫外灭菌30 min，等待温度将至85 ℃时分装至培养皿中，等待冷却备用。将保存在斜面培养基中的L-53，放于操作台中，紫外灭菌30 min。双手用75%酒精擦拭后进行操作，将要分离菌种的标本接种针用酒精灯灼烧灭菌2～3 次，冷却后在标本上挑取微量菌种于冷却后的平板上，平板倒置并用封口膜封口，在培养皿上写上日期及菌种编号，将平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养3～4 天。长期冷藏保存的菌种需经历2～3 次活化完成复壮过程，活化后的菌种能更好的适应外界培养环境，为后期大规模发酵培养奠定良好基础。

2.2 菌丝体的提取、分离与纯化

菌株L-53 经复苏后，与马铃薯葡萄糖肉汤培养基（Potato Dextrose Broth,PDB）一起放入超净台中灭菌30 min。将接菌环反复灼烧灭菌2～3 次，冷却后将已经纯化分离好的L-53 菌单个菌落挑出，并迅速伸入装有液体培养基的锥形瓶与液面衔接处，上下滑动摩擦瓶壁，使孢子成功接入液体培养基中。接菌后再用透气封口膜和棉绳封口。放入恒温震荡培养箱中培养3～4 d（28 ℃，150 r/min），获得种子培养液。L-53 菌株用马铃薯培养基大规模发酵，发酵200瓶（每1000 mL 的三角锥形瓶中加入200 mL 的培养液），在121 ℃的高温灭菌锅中灭菌20 min，待培养基冷却后接种，室温静置发酵30 d。发酵产物使用布氏漏斗进行减压抽滤将菌体发酵液和菌丝体分离，共得到菌体发酵液7.5 L，菌体鲜重80 g。将菌体浸入分析纯甲醇中，在40 KHz 条件下超声作用20 min 使细胞壁破碎，补充甲醇至料液比1:8，加热回流提取三次，每次2 h，合并三次提取液，浓缩后得到总浸膏共5.2 g。按1:1.5 比例加入80-100 目硅胶进行拌样，水浴挥干甲醇，湿法装柱，干法上样。用不同比例的二氯甲烷和甲醇进行梯度洗脱，依次以20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、3:1、2:1、1:1、甲醇进行洗脱，分别命名共收集A-I共九个组分。

其中H 旋蒸浓缩后在样品表面出现无色晶体化合物，用二氯甲烷:甲醇=1:1 溶剂重结晶析出得到透明无色结晶化合物1（15.62 mg）。向E 中样品添加少量的二氯甲烷:甲醇=4:1 溶剂长期处于0 ℃条件下析出一白色结晶化合物，用极性较低的石油醚对晶体进行3 次润洗得到的白色晶体化合物2（7.52 mg）。工艺流程图见图1。

图1 小花清风藤叶内生真菌菌体成分提取、分离纯化及鉴定工艺流程图

3 实验结果

3.1 D- 半乳糖醇的结构确定

化合物1 为透明无色晶体，易溶于热水(1:2)，溶于冷水(1:30)，微溶于乙醇。分子式为C6H14O6。1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6)（表1）显示δH：3.33-3.41 (4H,m)，4.32 (2H, t,J=4.52 Hz)，4.41 (2H, d, J=4.84Hz)，13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)（表1），δC：63.9(C-1,C-6)，69.7(C-2, C-5)，71.4(C-3, C-4)与已知文献[10]对照，数据基本一致，故确定化合物1 为D- 半乳糖醇，其结构（图2）。

图2 化合物1 的结构

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 数据(CD3SOCD3)

3.2 丙三醇的结构确定

化合物2 低温下呈现白色晶体（丙三醇长期放置于0 ℃低温处，能形成熔点为17.8 ℃的白色结晶）[12-13]，常温状态为无色澄清状粘稠液体。可混溶于乙醇，与水混溶，不溶于氯仿、醚、二硫化碳、苯、油类。分子式为C3H8O3。

根据1H-NMR（400 MHz,DMSO-d6）（表2）显示δH：4.28-4.48 为羟基氢，3.30-3.40（2H，m），3.49-3.58（4H，m），在13C-NMR（100 MHz,DMSO-d6）（表2）中δC：63.3（C-1, C-3），72.6（C-2）。

表2 化合物2 的1H-NMR 和13C-NMR 数据（CD3SOCD3）

以上波谱数据与文献[11]基本一致，故确定化合物2 为丙三醇（图3）。

图3 化合物2 的结构

4 结论与讨论

小花清风藤具较高的药用价值和临床价值，但小花清风藤资源分布少。目前人们获取临床所需药物主要是通过合成、半合成或从药用植物中提取。化学合成药物存在收率低、污染大、副产物多等弊端，而直接从药用植物中提取有效成分也受许多因素的限制。近年来，内生真菌及其次生的代谢产物研究都有明显进步，微生物发酵具有成本低、易于培养、产量稳定、周期较段、易于调控等优点。本文应用正相硅胶柱色谱、重结晶1H-NMR、13C-NMR 等方法对小花清风藤内生真菌Guignardia sp. 菌丝体的甲醇提取物的化学成分进行了系统研究，从部位中分离得到了2 个化合物，并应用理化性质、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱对其进行结构确证。对小花清风藤内生真菌进一步的开发利用，筛选活性物质，对保护维护小花清风藤生态环境与利用具有一定的科学意义。