小胶质细胞介导的神经元周围网络降解促进疼痛

一、主要研究背景

周围神经损伤导致疼痛敏化现象。受损的初级传入神经释放趋化因子、信号分子和蛋白酶激活脊髓小胶质细胞，进而增强脊髓伤害性感受通路的兴奋性。小胶质细胞释放一系列与细胞表面受体结合的生物活性物质，通过调节胞内过程来增加神经元活动。这些物质如何在不影响其他感觉形式的情况下特异性地敏化疼痛信号通路目前尚不清楚。既往对小胶质细胞影响脊髓神经元功能的研究主要集中在细胞内作用机制。中枢神经系统 (CNS) 细胞外基质成分为神经元提供结构支持，调控神经元的兴奋性和突触可塑性，但其在调节脊髓伤害性感受通路中的作用尚不明确。神经元周围网络(PNNs)是CNS 中最重要的细胞外结构，由硫酸软骨素糖链修饰的蛋白聚糖核心蛋白组成。在新皮质中，PNNs选择性地包裹快放电的小清蛋白阳性的抑制性中间神经元的胞体和近端树突，通过调节突触输入和内在兴奋性来调节它们的神经可塑性。该研究探讨了PNNs 在脊髓的分布以及在调节伤害性信息的脊髓神经元活动中的作用。

二、主要研究结果

1. 脊髓I 层中的PNNs 围绕投射神经元

紫藤凝集素 (WFA) 可特异性结合PNN 糖蛋白的糖胺聚糖 (GAG) 侧糖链，因此WFA 染色可以识别PNNs。此外，PNNs 也可以通过标记其核心蛋白成分聚集蛋白聚糖来显示。对脊髓切片的聚集蛋白聚糖进行免疫染色显示，PNNs 围绕背角I 层大直径神经元的胞体，呈现出内-外侧方向。高分辨率共聚焦Airyscan 成像显示，抑制性突触前末端结构位于PNNs 孔内。将荧光金 (FG) 注入臂旁外侧核 (LPb)的逆行追踪显示，脊髓I 层中的PNNs 选择性地存在于脊髓-臂旁核投射神经元附近，而在其他细胞类型周围未发现。脊髓I 层中PNN 阳性 (PNN+) 投射神经元的胞体明显大于PNN 阴性 (PNN) 投射神经元或其他神经元细胞类型。PNNs 稀疏分布在脊髓III 层，几乎不存在于脊髓II 层中。在脊髓IV 和V层中，在抑制性 (Pax2+) 和兴奋性 (Pax2', NeuN+) 神经元周围都发现了PNNs。将小鼠后爪暴露于机械（25 g 活页夹夹30 秒）或热（55℃水浴30 秒）伤害性刺激下，可诱导Fos 在脊髓I 层PNN+投射神经元中的表达，表明这类神经元参与编码疼痛相关的信息。

2.周围神经损伤后PNNs 的变化

为了研究脊髓中的PNNs 是否在周围神经损伤后发生改变，研究团队利用小鼠构建坐骨神经损伤模型 (SNI) ，该模型的特征是在神经损伤2～3 天后，小鼠的疼痛行为最为明显。SNI 造模后第3 天，WFA 标记PNNs 上的GAGs 在脊髓I 层投射神经元周围的丰度显著降低（降低76.3%），在损伤后1周和2 周仍维持低水平；而聚集蛋白聚糖的丰度未受影响。在脊髓深层的PNNs 未显示出明显的WFA染色变化。

3.小胶质细胞介导PNNs 的降解

CD68 的免疫荧光实验发现，SNI 第3 天，大多数小胶质细胞（有67.1%）的溶酶体中出现WFA标记的PNNs。在损伤后第1 周和第2 周，吞噬PNNs 的小胶质细胞比例明显减少。为了研究小胶质细胞在神经损伤后PNNs 降解中的作用，该研究团队使用在小胶质细胞中选择性表达白喉毒素受体(DTR) 的Cre 诱导型小鼠 (iDTR; TMEM119CreERT2)耗竭小胶质细胞。在这些小鼠，周围神经损伤未引起机械痛敏，且在SNI 造模后第3 天，脊髓I 层投射神经元周围的PNNs 没有出现明显减少，说明未引起PNNs 的降解。为了进一步证实小胶质细胞在PNNs 降解中的作用，使用缺乏CX3CR1 的小鼠，该受体介导小胶质细胞的激活和吞噬活性。免疫荧光实验结果表明，周围神经损伤后，Cx3crr´～型小鼠的小胶质细胞的增生与对照小鼠相似，但其小胶质细胞溶酶体数量显著减少，提示小胶质细胞吞噬活性减弱。同时，该基因型小鼠没有表现出疼痛过敏反应，这与既往的实验报道一致。在神经损伤后，Cx3crr´～型小鼠未出现脊髓背角I 层投射神经元周围的PNNs 的大量降解，并且在SNI 造模后第3 天检测到小胶质细胞中的WFA 表达显著减少。这些结果表明小胶质细胞介导周围神经损伤后的PNNs降解。

4.投射神经元周围PNNs 的降解介导疼痛相关行为

为了研究去除投射神经元周围的PNNs 是否会引起疼痛，研究团队通过将rAAV2-Cre 注射到Acan 小鼠的LPb 核中来敲除投射神经元中的聚集蛋白聚糖。rAAV2-Cre 逆向投射到LPb 核的神经元并表达Cre 重组酶，这些神经元包括脊髓I 层的投射神经元。验证发现，注射rAAV2-Cre 的Acari 小鼠脊髓I 层投射神经元周围的PNNs 被破坏。正常小鼠在热板实验中会出现舔爪、跳跃等反应，而注射AAV2-Cre 的Acania小鼠在热板实验中舔爪/跳跃的潜伏期显著缩短，特异性敲除脊髓I 层投射神经元周围PNNs 后引起了热过敏反应。同时，小鼠面部疼痛表情量表评估显示，去除PNNs 引起自发性疼痛。由于周围神经损伤减少PNNs 上的GAG而不影响聚集蛋白聚糖，并且既往方法靶向所有投射到LPb 核的神经元，研究团队利用表达硫酸软骨素酶(chABC)的AAV 选择性去除腰脊髓投射神经元周围的GAG。ChABC 特异性消化PNNs 上的GAG，已广泛用于研究PNNs 在神经系统中的作用。通过共同注射两种病毒载体：rAAV2-Cre 注射到LPb 核，Cre 依赖性方式表达chABC 的AAV(AAV9-DIOchABC)注射到腰脊髓，以实现腰段脊髓投射神经元表达chABC。这种方法导致脊髓I 层上的PNNs 中的GAGs 被去除而不影响聚集蛋白聚糖的表达，也不影响深层PNNs 的结构亦或是小胶质细胞激活。行为结果显示，腰脊髓投射神经元中去除GAG 的小鼠在热板实验中产生热过敏反应，并诱发自发性疼痛。

5.去除GAG 抑制脊髓I 层投射神经元

既往对皮质和海马的研究表明，PNNs 调节突触传递并影响神经元内在兴奋性。该研究团队发现PNNs 降解促进疼痛行为，促使他们研究去除PNNs的GAG 是否会增加脊髓背角I 层投射神经元的活动。

首先，研究通过量化抑制性 (VGAT+) 和兴奋性(VGLUT2+) 突触前的puncta 来评估PNN+投射神经元上的兴奋性和抑制性突触输入的数量。在PNN+投射神经元的胞体上，VGAT+显著多于VGLUT2+（多60%）。通过将AAV-chABC 注射到腰椎脊髓来消除PNNs 中的GAG 并没有改变PNN+投射神经元上兴奋性和抑制性突触前末端的数量。SNI 造模后第3 天，兴奋性和抑制性突触前末端的数量也保持不变。

为了研究GAG 去除对脊髓I 层投射神经元的活动的影响，使用全细胞膜片钳记录测量了离体脊髓片上这类神经元的突触输入及其内在兴奋性。采用带有LED 的倾斜红外照明设备可识别并用膜片钳记录完整脊髓中被PNN 包围的大直径 (＞ 20 μm)且呈内-外侧方向的脊髓I 层神经元。为了确认这些神经元周围是否存在PNNs，将钳到的细胞中注入染料Alexafluor488，然后进行固定和蛋白聚糖免疫染色。用chABC 降解GAG 导致膜电位去极化(4.8±1) mV 和动作电位放电频率增加，而不会改变PNN+神经元的膜电位和放电率，并且这种效应是PNN+神经元特有的。对自发微小突触活动的分析表明，chABC 降低了微小抑制性突触后电流的频率（mIPSC，减少48%），但不降低其幅度。此外，在存在突触受体拮抗剂混合物（AP-5、DNQX、荷包牡丹碱和士的宁）以抑制兴奋性和抑制性突触活动的情况下，PNNs 的降解对投射神经元的被动膜特性和内在兴奋性没有影响。为了证实神经损伤后PNNs 的破坏伴随着抑制性输入的减少，在SNI 造模后第3 天记录了脊髓I 层PNN+投射神经元，发现mIPSC 的频率显著降低。这种减少在小胶质细胞耗竭的小鼠中得到抑制，但可以通过用chABC 去除PNNs 来恢复。与这些结果一致的是，神经损伤引起的自发性疼痛通过消除小胶质细胞得到缓解，但能通过去除脊髓I 层投射神经元周围的PNNs 来恢复。

三、讨论

该研究表明在脊髓背角I 层存在一类投射到外侧臂旁核的神经元，可选择性被PNNs 包裹。当周围神经损伤后，以小胶质细胞依赖性方式降解。PNNs 的降解足以通过减少抑制性突触输入来增强投射神经元的活动，并促进疼痛行为。

在皮质和海马中，PNNs 主要存在于小清蛋白阳性的抑制性中间神经元周围，而在脊髓背角中，PNNs 仅存在于脊髓I 层大直径投射神经元周围，并在深层中围绕各种神经元类型。PNNs 在投射神经元周围的选择性定位具有高度的特异性，使通过调节PNNs 来调节投射神经元的活动具有可操作性。由于投射神经元是脊髓疼痛环路的主要输出，因此通过降解周围的PNNs 来激活投射神经元是增加脊髓伤害感受环路输出的一种特定且有效的机制。

突触终末包埋于PNNs 中，因此PNNs 的组成和稳定性对突触活动有重要影响。去除PNNs 中带负电的硫酸盐基团可能导致突触结构的不稳定并降低突触传递的有效性。小胶质细胞通过多种机制促进疼痛状态。例如，小胶质细胞介导的KCC2 下调使胞内氯增加并减少抑制性传入，从而促进神经病理性疼痛。在神经损伤后7 天，I 层和II 层多种细胞类型出现KCC2 的下调和氯的异常。在损伤后3天，小胶质细胞介导的PNNs 降解选择性地增强了一部分脊髓I 层投射神经元的活动。因此，小胶质细胞可能以不同的机制发挥作用，反映了神经病理性疼痛机制的复杂性和鲁棒性，表明有效的治疗应该针对几个过程来逆转过敏反应。此外，小胶质细胞参与介导慢性疼痛的性别差异已经得到证实，但该研究发现PNNs 的小胶质细胞依赖性降解及其对突触活动和疼痛相关行为的影响在雌性和雄性中都存在。

综上所述，该研究团队的工作揭示了小胶质细胞在周围神经损伤后去抑制投射神经元。这些发现提示靶向这个新机制可能是开发神经病理性疼痛治疗的新策略。