杉木-丛枝菌根共生机制对不同形态磷的解吸效率

宁晨，向雪莲，张宇蒙，王小丹，张采依，林先滢

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.南方林业生态应用技术国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

磷（P）是植物生长必需的矿质元素，其含量约占植物体干重的0.2%。植物很多生理过程需要P 的参与，包括关键植物功能基因的合成，核酸细胞膜的构建、光合呼吸作用等能量储存、迁移、转化过程，最后以枯枝落叶的形式将一部分P 元素归还到土壤中[1]。植物的直接P 源是土壤中的水溶态，主要通过矿物态P（以被氧化氧化铁胶膜包蔽的闭蓄态磷酸盐和磷酸铁盐为主）、吸附态P（土壤胶体、有机物和铁铝矿物吸附）、有机态P（肌醇磷酸盐为主）被植物根系或微生物活动进行释放[2-4]。这些迟效状态的P 占土壤中总P 的95%～99%，因此土壤有效P 匮乏是世界范围内植物生产力的主要限制因素之一[5-6]。我国南方酸性红壤有效P 匮乏尤为严重，成为限制热带和亚热带区域植物生长发育和生产力的主要因素[7-10]。

丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）是自然生态中一种广泛存在的植物共生真菌，它能够与大部分维管类植物根系形成共生体系。丛枝菌根指层内有丛枝和无隔菌丝等结构的共生体系。而丛枝是指形成于植物皮层细胞内，进入细胞内的菌丝经过连续的双分叉分枝而形成的灌木状结构。在自然生态系统中，约80%的维管植物能形成菌根共生体（mycorrhizae），其中丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）能够与地球上90%的维管束植物形成共生关系[11]。很多报道已指出AM 真菌能够促进寄主植物生长，使其适应低磷土壤[12]和破碎化土壤、提高植物磷获取能力[13-14]。一方面，菌丝直径为20～50 μm，纤细的菌丝能够深入土壤缝隙，在土壤湿度较低的环境中充分利用土壤溶液中植物根系所不能利用的有效磷，且能够减少吸收面损耗的P[15]。与土壤有效P 含量充分的土壤相比，植物根系在有效P 相对贫乏的土壤中更能形成高密度的菌丝。另一方面，菌根真菌能够分泌的螯合剂（如柠檬酸和植物铁载体）和酶类（如磷酸酶），催化水解有机物中的碳和磷酸键释放出磷酸，从而提高土壤可被植物吸收利用的有效P 含量[3,8,16-19]。除此之外，王明元等[20]发现AM 能通过提高柑橘根系三价铁（Fe）螯合物还原酶（ferric-chelate reductase,FCR）活性，提高基质中Fe 的氧化还原能力，从而使更多的三价Fe 转化为二价Fe，降低其对土壤中水溶态P 的吸附作用。由此可见，菌根侵染和其附带的生态功能（有机酸、磷酸酶、Fe 还原等）与宿主植物的P 素循环密切相关，真菌菌丝在土壤植物之间起着重要的养分传递作用。杉木Cunninghamia lanceolata是一种我国南方亚热带常见树种，由于生长速度快、经济价值高在我国南方得到广泛种植，成为了南方主要的人工林。但是由于人工林纯林化、经营集约化和多代连栽现象加剧，导致杉木林地普遍出现地力衰退、初级生产力下降的现象，这些都制约着我国杉木人工林的可持续发展。大部分杉木生长的地区都属于高度风化和淋溶的典型薄层湿老成土，土壤出现缺磷现象[21-22]。丛枝根菌真菌是自然环境中一种普遍存在的微生物，它能够通过土壤侵染植物的根系，侵染后植物的根系对氮、磷等营养元素的吸收被增强，改善了植物营养状况促进了植物的生长。由于土壤中的磷形态多样、各种反应形式复杂、土壤中磷的形态也会因为调查样地不一样而呈现不确定性，而对植物-菌根共生系统如何提高利用磷的能力仍需进一步研究探索[23]。因此，本项目通过研究杉木菌根在不同条件下对各种形态磷的转化机制和利用效率，将能更好地解决杉木生产区土壤磷限制的现象，从根本上解决了人工林经营方法和相关管理的问题。

1 材料与方法

1.1 研究区概况和试验材料

接种土壤采自湖南会同杉木林生态系统国家野外科学观测研究站（109°45′E，26°50′N）。当地气候属典型的亚热带湿润性气候，年平均气温16.8℃，年降水量为1 100～1 400 mm，相对湿度为80%以上。地貌为低山丘陵，海拔300～500 m。土壤为变色页岩和砂岩发育成的山地黄壤，pH 值4.9～5.1。接种土壤通过10%次氯酸钠溶液消毒后的铁锹采集，过2 mm 筛，混匀后装密封袋保存避免污染。

1.2 试验设计

本试验设定磷限制组（对照组）和非磷限制组(添加KH2PO4），同时在各组内各设置5 种不同磷素生长包，每种磷素生长包各设置3个重复组，共30 个样本。

选用规格为13 cm×10 cm 的瓦式盆钵，基质土选取泥炭土∶珍珠岩按体积1∶1 比率混合，80℃烘干2 h 进行灭菌处理，其中非磷限制组基质土中每千克加入87 mg KH2PO4，将土壤有效磷含量提升至20 mg/kg，形成P 限制和非P 限制两种环境。选用预先催芽、生长情况良好、长势相当的6 月龄杉木实生苗栽种于盆中并接种菌根土。在中南林业科技大学南方林业生态应用国家工程实验室的室内温室中按光照∶黑暗=13∶11，温度高于当地气温2℃，土壤湿度维持在80%左右，培养3 个月。

针对在盆钵中放置的P 的种类设置对照实验。共设置4 种P 形态以及对照进行对比：正磷酸盐（CaPO4)、麦麸（有机磷）、KH2PO4浸泡的Fe2O3，磷灰石以及不含磷石英砂（对照），各5 g的量，灌入孔径300 目（50 μm），5 cm×5 cm 的尼龙沙包中，将其埋入幼苗根系的一侧。

1.3 样品采集与测试分析

经过6 个月生长期后将生长包取出，将内部基质利用10 mL 蒸馏水匀速震荡30 min 后静置，取上清溶液利用微量板荧光法测定酸性磷酸酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酶的活性[24]。对杉木根系利用根系分析系统WinRhizo 2013（Regent Ins Inc,Canada）测定细根构型，利用醋酸墨水染色法测定杉木幼苗菌根侵染率。最后采用钼锑抗比色法测定植物P 含量、采用凯氏定氮法进行全氮测定以及采用重铬酸钾水合加热法测定植物有机碳含量。

1.4 统计分析

采用Excel 2019 软件整理试验数据，采用SPSS 13.0 统计软件进行One-way ANOVA 分析和相关性分析，用Tukey HSD 法和T 检验进行差异性检验，采用R 4.2.0 软件ggcor 包作相关性分析图。

2 结果与分析

2.1 土壤有效磷调控下不同磷源供应处理对杉木-丛枝菌根共生体养分吸收的影响

单因素方差分析结果（图1）表明，不同磷源对杉木P 含量（P＜0.05）具有显著性差异而对杉木C 含量和杉木N 含量无显著性差异（P＞0.05）。在磷添加情况下，对照组中杉木P 的含量最高，其次为铁吸附磷＞有机磷＞矿物磷＞正磷酸盐。在缺磷条件下添加不同磷肥对杉木P 含量具有显著性差异，其中对照组杉木P 含量显著高于其他4种添加，其次是添加有机磷和铁吸附磷含量较高。磷添加能够增加植株P 素的含量，并且有3 组（有机磷、矿物磷、铁吸附磷）在不同磷水平下，杉木P 含量呈现显著差异（P＜0.05）。在磷添加条件下，3 种不同磷源（对照、矿物磷、正磷酸盐）都会使得杉木N 含量高于未添加磷肥。在缺磷条件下，铁吸附磷可以显著增加植株C 含量，且在磷添加条件下显著高于未添加磷。反之，在缺磷条件时，矿物态磷源能够显著提高植株的C 含量。

图1 磷胁迫调控下不同磷源生长包对杉木幼苗养分含量的影响Fig.1 Effects of different phosphorus source growth packages on nutrient content of Cunninghamia lanceolata seedlings under phosphorus stress

2.2 土壤有效磷调控下杉木-丛枝菌根共生体对不同磷源供应处理的酶活性变化响应

β-葡萄糖苷酶活性在不同磷水平下5 组不同供应磷源处理之间结果差异显著（图2a）。在磷添加条件下，按酶活性大小依次排序是矿物磷＞有机磷，对照组、铁吸附磷组及正磷酸盐组酶活性为0 mol/gh，而在有机磷和矿物磷的情况下酶活性性提高，说明杉木根系真菌在磷充足的条件下偏向于对有机肥及复杂无机磷化合物的分解，以及加大回收利用矿物磷中的有机物（如残存菌丝），有效地增强分解纤维素物质的酶活性。在缺磷条件下，酶活性从大到小排列依次是铁吸附＞矿物磷＞正磷酸盐＞有机磷＞对照，4 组处理组皆高于对照组，且除铁吸附磷组以外其余各组差异不明显，但铁吸附处理组在缺磷条件下与其余各组都存在显著差异。该结果说明在缺磷条件下，杉木根系真菌偏向于对吸附态的磷素分解，并且大量分泌纤维素相关有机物回收利用真菌有机残体。5组磷处理中，分别有3 组（有机、矿物、铁吸附，t 检验P＜0.05）在不同磷水平条件下差异显著，说明磷素的水平对杉木根系真菌群落有机物利用，尤其是纤维素物质存在明显的差异导向性。

图2 磷胁迫调控下不同磷源生长包中菌根群落酶活性Fig.2 Enzyme activity of mycorrhizal fungal community in growth packages of different phosphorus sources under phosphorus stress

乙酰氨基葡萄糖苷酶活性在接种菌根的杉木植株土壤中在5 组磷处理之间差异明显，在磷添加条件下5 组酶活性从大到小依次排列分别是有机磷＞对照＞矿物磷＞正磷酸盐＞铁吸附磷，除有机磷处理组外，其他组酶活性皆低于对照组（图2b）。在缺磷条件下5 组酶活性从大到小依次排列分别是矿物磷＞对照＞铁吸附磷＞正磷酸盐＞有机磷。5 组中除矿物磷和正磷组外，其他3 组磷处理分别在缺磷和有磷条件之间差异性显著，尤其在磷素充分的情况下，导致杉木幼苗接近氮限制状态，从而激发其对周围几丁质（有机氮）类有机物的分解。

在接种菌根的植株中磷水平和不同磷分的添加对酸性磷酸酶活性有显著作用（图2c）。在磷添加条件下，酶活性从大到小依次是矿物磷＞对照＞正磷酸盐＞有机磷＞铁吸附磷，其中矿物处理组酶活性明显高于对照组，各个组别之间差异性显著。在缺磷条件下，酶活性从大到小依次是矿物磷＞有机磷＞正磷酸盐＞铁吸附磷＞对照，所有4 组磷处理的酶活性皆高于对照组。5 组中，有机处理和对照处理在不同磷水平处理下差异性显著，说明杉木幼苗在磷限制的条件下，会激发其共生真菌群落对有机磷素的获取。

2.3 缺磷调控下不同磷处理对杉木幼苗菌根侵染率的影响

在5 种不同磷素添加的处理下，铁吸附磷侵染率最高，矿物磷其次，正磷酸盐处理居中，有机磷处理与对照处理次序最低（图3）。因此得出，在铁处理下杉木幼苗对菌根的需求最高，而未额外添加磷处理的对照组的菌根侵染率并不高。通过T 检验分析，发现任意磷处理下不同磷水平对杉木幼苗菌根侵染率并不存在显著差异（P＞0.05）。

图3 磷胁迫调控下不同磷源生长包对杉木幼苗菌根浸染率的影响Fig.3 Effects of different phosphorus source growth packages on mycorrhizal colonization rate of Cunninghamia lanceolata seedlings under phosphorus stress

2.4 杉木幼苗的养分含量、菌根胞外酶活性、菌根浸染率之间的相关性分析

将杉木幼苗的碳、氮、磷含量、β-葡萄糖苷酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、根系侵染率之间进行相关性分析，其结果如图4 所示。在磷添加的条件下，杉木幼苗共生菌根的β-葡萄糖苷酶与酸性磷酸酶呈现显著正相关，这表明在有菌根接种的情况下，植物在不受到磷胁迫的条件下，会通过菌根及其菌丝际微生物胞外酶活性来加速有机物的分解，β-葡萄糖苷酶的提升可能与酸性磷酸酶呈现协同反应。在磷胁迫（无磷添加）的条件下，杉木幼苗的磷含量与根系的侵染率呈现存在显著负相关相关，说明在磷限制条件下，植物会选择尽量使更多菌根侵染来吸收更多的磷以供其自身生长。

图4 有效磷调控下杉木幼苗养分及菌根酶活性的相关性Fig.4 Correlation of nutrients and mycorrhizal enzyme activities in Cunninghamia lanceolata seedlings under available P treatment

3 讨论

研究表明，土壤中有效磷素的状态会直接影响杉木-AM 真菌共生体对土壤中异质磷源的利用模式。在磷添加调控下，杉木根系-AM 菌根共生体对有机磷源有着显著的偏向性，而在磷添加状态下，共生体则更偏向于易分解磷素。金鑫等[25]发现过多或者过少量磷肥的施加都会抑制植物根系的生长，只有在中等磷供应水平下才能够促进根系的生长，并且磷酸盐饥饿响应因子在低磷条件下会激活低磷响应因子从而增加磷素的获取。在缺磷调控下，AM 真菌由于磷胁迫机制会激发根系和菌根共生体获取更多磷元素，添加磷肥反而使得土壤中磷过多从而抑制AM真菌获取磷元素。在5 组磷处理中，对照组的植株磷含量最高，这可能是由于外源环境无可利用养分，宿主并未分配养分元素给共生真菌发挥传递和分解养分的功能。在正磷酸盐和铁吸附态磷处理中，植物氮含量和碳含量有所增加，说明添加这2 种磷素可能会促进杉木-丛枝菌根共生体协同生长，激发宿主植株的养分贮存，以此支持菌根及菌丝际微生物更好地获取土壤中的磷素。同时，这也是由于正磷酸盐和吸附态磷都属于容易被菌根共生体吸收分解的磷。

吴文景等[26]在对杉木的研究中发现，植物根系的形态和生长还受到所吸收的营养物质浓度和营养元素的组成形式的影响，在低磷情况下，杉木根系总长度和根冠比都较高。整个植株干物质向下分配高于地上部分，从而增大了根系与土壤的接触面积，以及通过增加AM 菌根的侵染率，使得根系及菌根际能够大范围地扩展，从而更加高效地利用土壤中的有效磷[27-28]。谭明曦等[29]在对油茶林进行不同浓度的磷添加和AM 接种的试验中发现，相较于高磷时无显著变化的株高和地径，低磷时株高和地径显著提高，表明低磷时AM真菌能够扩大根系的吸收面积，促进油茶的生长，提高油茶的生物量。冯曾威等[30]在对番茄根系的研究中发现AM 真菌的形成在最大程度上影响着寄主植物的生长，菌根的生长包括了根内菌丝和丛枝两部分，AM 真菌对磷的运输能力远高于根内菌丝，因此不同的供磷水平和丛枝的生长都对侵染率有着极为重大的影响。本研究发现，缺磷条件下施加正磷酸盐和铁吸附态磷有助于根尖丛枝分叉数及侵染率的增加，以此来提高运输磷的能力，使得杉木-菌根共生体系获取更多磷素。

接种AMF 可以提高土壤中磷酸酶活性，而磷酸酶可以促进土壤中的有机磷转变为植物可以吸收的无机磷。闫海丽等[31]发现在缺磷调控下，植物根系和AMF 均会受到激发，诱导产生磷酸酶以适应缺磷环境。此外，依据本研究数据可以推测，在缺磷调控下施加磷肥对磷酸酶活性的影响不显著，但有提高磷酸酶活性的趋势，其中添加磷灰石组磷酸酶活性升高趋势更明显，说明缺磷调控下添加磷灰石更有利于AMF 对磷素的获取。

NAG 酶为几丁质酶，可以分解土壤中的有机氮，是土壤中有机氮含量的主导因子[32]。在5 组不同磷源处理之下，有机磷处理组NAG 酶活性最强，这可能是因为NAG 酶的作用机理与土壤及AMF 菌丝际中的微生物相关，有机养分的增加可以增加该区域微生物群落的丰富度。由于微生物的增加提高对氮元素的需求，从而通过提高氮相关有机物分解，如组成真菌细胞的几丁质。而该过程主要通过真菌和菌丝际微生物提高酶活性来实现。因此，在磷分充足的水平下，施加有机磷可有效满足植株对N 的吸收，以此获得最大收益。

β-葡萄糖苷酶（BG 酶）是多糖分解酶，其主要针对土壤有机物和植物组织中的二糖和三糖化合物，其活性反映了土壤有机碳的积累与转化效率。在磷分充足的条件下，有机磷和磷矿石处理组能够较大程度地增强BG 酶活性。而在缺磷条件，只有施加铁吸附磷时才能显著提高β-葡萄糖苷酶的活性。研究结果与邓少虹等[33]的试验结果不同，其对牧草进行氮、磷、钾3 种不同养分施加再与对照空白组进行对比，所得结论认为BG 酶活性会因施加肥料而下降。但本试验结果与曾艳等[34]对桑园土壤酶活性的研究结果相似，即施肥有利于增加土壤多糖酶活性。

此外，根据相关性分析，无菌根接种时杉木幼苗P 含量与根系性状数据呈显著负相关，根据Lynch[35]的研究结果，当土壤中磷素缺乏时，植物需要伸长根系以便能够吸收到更多的磷素来供其生长。而有菌根接种时，杉木幼苗的P 含量与根系性状数据的负相关现象消失，说明接种AMF 有效促进了植物对其根系微环境中养分的吸收，减轻植株对根系长度的依赖。但其内在机理、吸收转运过程值得继续深入研究，随着同位素示踪技术和DNA 分子技术的发展，接种AMF 条件下营养元素从土壤到植物体的一系列过程，包括磷元素的转化和传递、AMF 物种和杉木的宿主偏向性等机理还有待进一步研究。

4 结论

添加过多的磷素会抑制杉木-丛枝菌根共生体对土壤中磷素的积累，但同时会提高杉木幼苗对其他元素如氮元素的累积。在磷添加的调控下，杉木幼苗为了满足磷分的需求而诱导共生菌根群落向其他养分元素的获取，其中对有机质和复杂矿物态养分来源尤为明显。而在缺磷条件下，易被利用的磷肥如正磷酸盐和铁吸附磷更有助于共生体系获取磷素，从而促进植株的生长发育。因此，在杉木幼苗管理、人工造林过程中施加磷肥时应同时考虑立地条件（尤其是土壤有效磷）及施用磷肥的形态。