血清miRNA-21-5p、miRNA-122-5p表达水平对绝经后骨质疏松性髋部骨折的诊断价值评价

李毛召，龙果，李文强

1.喀什地区第一人民医院，新疆 喀什 844000；2.巴楚县人民医院，新疆 喀什 843800

0 引言

骨质疏松性髋部骨折是常见的疾病之一，而绝经后的女性受到年龄的增长，更容易出现骨重建失衡，在患者绝经后其雌激素水平相对更低，而雌激素对破骨细胞的抑制作用也就相对降低，因此导致破骨细胞数量增加及凋亡减少，从而影响患者的骨吸收功能。miRNA参与的表观遗传在骨代谢过程中发挥着重要作用，当miRNA含量出现变化时期调节的靶基因表达水平也可随之改变，而在病理条件下，异常的miRNA信号网络能够作为骨质疏松疾病的发生与进展诊断指标[1]。对此，本文将本院收治的骨质疏松性髋部骨折患者血清miRNA-21-5p、miRNA-122-5p表达水平情况，旨在分析两项指标的诊断价值，详见下文所示。

1 资料和方法

1.1 一般资料

将我院2020年1～12月收治的髋部骨折患者作为研究的观察对象，共有60例患者，分为四个组别，分别为正常组、骨质减少、骨质疏松症、严重骨质疏松症组，每组15例，其中正常组年龄49～74岁，平均（61.25±2.54）岁；骨质减少组患者年龄49～78岁，平均（61.23±2.56）岁；骨质疏松症患者年龄51～79岁，平均（61.27±2.52）岁；严重骨质疏松组患者年龄52～76岁，平均（61.23±2.55）岁。四组患者的一般资料对比无差异（P＞0.05）。

纳入标准：血常规、生化、骨骼转化指标P1NP和S-CTX，骨密度及其他所有术前必要的检查准确相关疾病者；所有纳入本研究的患者均需要被详细告知研究方案，充分理解并同意签字；所有研究方案及过程需要经过我院伦理委员会审批通过。

排除标准：年龄少于49岁；患有其他骨骼-肌肉代谢性疾病、糖尿病、其他种类的代谢性疾病；乙肝、丙肝、HIV以及因其他疾病原因服用糖皮质类；本次入院前未进行正规抗骨质疏松治疗；未使用其他含有激素类影响人体代谢的药物长达1个以上的患者或因基础疾病无法耐受手术的患者。

1.2 方法

miRNA分析：RNA的提取，本实验选用传统Trizol法和专用于miRNA提取的miRNA试剂盒（Tiangen公司），并比较两者提取效率差异。分别取300μL血清、2mg组织于无核糖核酸酶（Rnase）的EP管中，加入有1mL TRLZOL的离心管中，混匀。室温放置5min以上，加入200 mL的氯仿，颠倒混匀后室温放置2～5min。4℃，12000rpm离心15min，吸取上清于另一个新的离心管中，加入等体积的异丙醇混匀，-20℃放置30min以上。4℃，12000rpm离心15min，倒掉上清液。加入75%的乙醇，使沉淀漂浮起来洗涤。4℃，12000rpm离心15min，倒掉上清液。用无RNA酶的水溶解沉淀，浓度测定与1.5%琼脂糖凝胶电泳，125V、17min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察结果。剩余RNA置于-80℃保存。miRNA的逆转录：采用复能基因公式的cDNA合成试剂盒，该法在逆转录之前先多聚A加尾，多聚A加尾法逆转录后可供检测多种miRNA。取上述miRNA溶液18μL按要求制成25μL反应体系；于PCR仪器中37℃60min，后85℃+5min；cDNA溶液保存于-30℃，备用。miRNA的qPCR定量检测：实时检测miR-16和miR-21表达量采用复能基因公司的All-in-OneTMqPCRMix。上述cDNA溶液稀释10倍后，取5.6μL稀释液按说明书制成20μL的PCR反应体系。于ABI7500实时PCR仪器上检测SYBRGREEN反应信号，扩增曲线后加入溶解曲线以确认扩增产物的特异性。所有的PCR反应均行3副孔，循环阈值（Cq值）的原始数据随后使用插入控制分析和缺失值的归算来消除技术差异。

1.3 观察指标

在患者纳入后分析四组患者血清及股骨头组织中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平变化，同时对比正常组与骨质疏松性髋部骨折组的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p变化，并分析miRNA-21-5p、miRNA-122-5p对疾病的敏感度、特异度及准确性。

1.4 统计学方法

使用SPSS 20.0软件计算，计数资料、计量资料表示为（%）（），分别采用卡方检验和t检验，如组间对比结果为P＜0.05，则表示有统计学差异。

2 结果

2.1 分析四组血清及股骨头组织中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平变化

四组患者的血清及股骨头组织中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平之间进行对比分析可见，血清与股骨头之间的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平对比并无明显差异（P＞0.05），详见表1所示。

表1 四组患者血清及股骨头组织中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 水平变化对比分析（）

表1 四组患者血清及股骨头组织中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 水平变化对比分析（）

注：*与血清检查结果对比并无明显差异（P＞0.05）。

2.2 分析正常组与骨质疏松性髋部骨折组的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p变化

骨质疏松性髋部骨折组患者的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平明显更高于正常组患者，对比统计学差异明显（P＜0.05），详见表2所示。

表2 正常组与骨质疏松性髋部骨折组两组间的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 变化对比分析（）

表2 正常组与骨质疏松性髋部骨折组两组间的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 变化对比分析（）

注：*与血清检查结果对比并无明显差异（P＞0.05）。

2.3 分析miRNA-21-5p、miRNA-122-5p对疾病的敏感度、特异度及准确性

miRNA-21-5p、miRNA-122-5p对疾病的敏感度、特异性及准确性明显更高，详见表3所示。

表3 miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 对疾病的敏感度、特异度及准确性分析（%）

3 讨论

近年来，受到我国人口老龄化等多种因素的影响，导致骨质疏松症患病率逐年增长，同样，随着我国老龄化进程的加快，我国骨质疏松症患者的发病率远高于临床统计的数字，而作为最严重的骨质疏松性骨折，髋部骨折是近年来我国常见的骨折疾病，发病率同样呈逐年增长的趋势。骨质疏松症是临床常见全身骨骼疾病，在出现骨量降低及骨组织微结构损伤后导致患者骨脆性的增加，容易导致骨折的发生[2-3]。同时，在骨质疏松患病率逐年增长后，由于骨质疏松引起的骨折等多种疾病也在不断提高，甚至部分患者出现致残或致死，而骨质疏松症已经成为当前全球关注的重点。一般情况下，在女性患者绝经后可见，患者受到雌激素水平下降的影响，患者体内骨重建的活跃及失衡容易导致小梁骨变细或断裂，最终导致皮质骨孔隙度增加，降低骨强度[3]。此外，当患者体内的雌激素水平降低时，患者的骨骼对力学刺激敏感性相对更低，这就导致了患者出现骨丢失等的病理改变。而患者年龄增长及雌激素降低的同时可导致免疫系统持续低度活化，最终使身体处于促炎性状态，加重了骨重建失衡症状。

miRNA首次在秀丽新小杆线虫的线粒体中被发现，在此之后，大量的miRNA被鉴定和研究，部分miRNA在细胞外，通常被称为循环miRNA或胞外miRNA，在各种生物液体或细胞培养基中均可发现，此类miRNA可参与细胞的调节与细胞间的通讯[4]。此外，大量研究表明miRNA能够直接参与到细胞的生长、分化等一系列的过程中，特定miRNA水平的改变与多种疾病有关，miRNA表现出的高度时间和空间特异性表明其可作为评估疾病发生发展的可靠指标[5]。既往研究已显示，骨质疏松症及其骨折的发生与否主要由基因决定，miRNA与骨质疏松等多种11代谢性疾病的相关性，在病理条件下，异常的miRNA信号网络被证实可参与原发性和继发性骨质疏松等疾病的发生与进展[6]。miRNA能够参与到骨代谢中，同时能够在遗传中有一定的作用，其能够在一定程度上影响到细胞的分化方向，同时能够诱导靶miRNA特异性结合，导致其发生降解或翻译抑制。与此同时，miRNA含量降低或上升的状态下患者体内的靶基因表达水平也会受到一定程度的影响，从而引起多种临床症状的发生[7]。有学者研究表明，骨质疏松与miRNA代谢紊乱状态有较高的相关性，miRNA表达水平的变化可影响到骨代谢信号通路发生变化，miRNA能够利用成骨分化、破骨细胞分化的调节从而改善人体的骨代谢能力，并且，骨质疏松与miRNA异常表也与骨代谢有着紧密的联系[8]。此外，miRNA的表达与高骨吸收之间也存在一定的功能联系，能够拮抗人体骨髓间充质干细胞中的miRNA以提高破骨细胞的分化能力，提示miRNA调节骨吸收有一定影响[9]。细胞分化回一个较为复杂的生理过程，而调节细胞的特征性表达则与转录因子的变化有着一定关联，通过miRNA活性调节则能够帮助提高转录因子表达的能力，同时又能够调节细胞的变化生理过程[10]。更有研究学者表明，基因多态性能消除一个miRNA结合位点，并能够创建一个新的位点帮助改变miRNA靶蛋白的表达情况，而miRNA启动子中的3处发生的自然的基因多态性则被证明可能与白种人股骨颈骨密度有一定的关联[11]。而有研究证实，miRNA广泛存在于机体的血清及血浆中，其能够耐RNA酶消化等，不会受到患者创伤后应激反应的影响，同时，血清miRNA能够随着患者生理状态及疾病病情变化而变化，提示miRNA能够作为体内生理状态的无创的实时检测指标，通过纠正miRNA失调的miRNA的方式改善患者骨代谢紊乱[12]。

综上所述，miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平均能够作为当前骨质疏松性髋骨折患者临床诊断指标之一，通过对miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平的分析能够对骨质疏松等疾病进行预测及诊断，并可有效观察患者的疾病严重程度，可作为骨质疏松性髋骨骨折患者的诊断指标。