多功能复合菌对玉米幼苗镍和镉胁迫的解毒特征及其机理

2022-12-02杨昳张羽尹秋霞李明堂

农业环境科学学报 2022年11期

杨昳，张羽，尹秋霞，李明堂

（吉林农业大学资源与环境学院，长春 130118）

镍（Ni）和镉（Cd）会随污水排放、矿渣淋滤、农业投入品的施用等途径进入玉米种植土壤，当含量积累到一定程度时会造成土壤污染，影响玉米的生长和品质，最终影响粮食安全，并威胁人体健康[1]。过量的Ni和Cd不仅能抑制种子萌发，在作物生长发育的阶段还会严重影响其分枝发育，破坏细胞结构，干扰分裂增殖，致使作物失绿变形和叶片坏死，扰乱根尖有丝分裂，影响作物生长，降低生物量的同时影响作物对营养元素的吸收[2-3]。《全国土壤污染状况调查公报》显示，在我国Ni和Cd两类重金属的点位超标率分别为7.0%和4.8%，已高居前二位，污染问题较重。此外，与单一重金属污染相比，多种重金属并存的复合污染问题更加普遍，且缺乏有针对性的修复技术。玉米是世界范围内用于动物、人类营养以及农业工业用途最主要的农作物，也是吉林地区最主要的农作物之一[4]。水培研究常被许多研究者用于植物种子萌发实验以及调查植物幼苗对重金属元素的吸收和迁移机制[5-6]，有研究表明，生长至幼苗时期的玉米对Ni 和Cd 胁迫较为敏感，在无土栽培条件下，高于5 mg·L-1的Ni和Cd 会使玉米幼苗各部位均受到显著损伤，最终显著降低其产量[7-8]。

微生物因其功能多、适应力强、无二次污染和可与作物根系共生等特征，近年来在缓解重金属对作物的毒性，提高作物对重金属胁迫的抗逆性方面越来越受到人们的重视[9]，如DARY 等[10]研究发现接种一株具有产IAA（吲哚-3-乙酸）的芽孢杆菌提高了在Cd、Cu 和Pb 等多种重金属胁迫下的作物产量，并降低作物根部和茎叶部 Cd、Cu 和 Pb 等的积累；LIU 等[11]利用了一株巴氏芽孢杆菌诱导碳酸盐沉淀的功能明显降低了环境中Cd、Pb 等多种重金属污染的毒性。但已有的研究在微生物缓解重金属对作物毒性方面主要是利用具有单一功能的单一菌株，并且主要研究缓解与修复效应等，对于微生物缓解重金属毒性的效应机理的相关研究较少[12-14]。沙福芽孢杆菌可通过产植物促生物质和生物吸附等机理促进非生物胁迫下小麦的生长以及污水中Al3+的去除[15-16]，睾丸酮丛毛单胞菌可通过生物吸附和生物矿化等机理来降低Cd对水稻的毒性以及增强污水中污染物的生物固定作用[17-18]，但这两类菌组成的复合菌对玉米幼苗Ni 和Cd 胁迫具有怎样的解毒作用，以及通过何种机理来降低Ni和Cd对玉米幼苗的胁迫尚不明确。

本课题组从Ni 和Cd 污染土壤中曾分离获得了两株抗Ni 和Cd 的土著有益微生物，一株为沙福芽孢杆菌N4，该菌可产IAA[19]，另外一株为睾丸酮丛毛单胞菌ZG2，该菌产脲酶、IAA 和铁载体，并可诱导形成重金属的碳酸盐矿物晶体沉淀[20]。本研究分析研究这两株菌组成的复合菌与玉米幼苗的共生作用，对玉米幼苗Ni 和Cd 胁迫的解毒特征及其作用机理，以期为利用复合菌修复Ni 和Cd 污染土壤，保证玉米安全生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试玉米（Zea maysL.）为金苑玉z658，品种审定编号为辽审玉20180155，品种来源为CY04×TY04。

供试菌株为本实验室从Ni 和Cd 复合污染的土壤中分离筛选出的对Ni 和Cd 均具有较高抗性的沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）N4 和睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）ZG2。菌株N4具有较强的产 IAA 能力，Genbank 登录号为 NR 041794.1，并能协同生物炭降低小白菜对Ni 和Cd 的吸收[19]。菌株ZG2具有产脲酶、IAA 和铁载体，并可诱导形成重金属碳酸盐沉淀的功能，Genbank 登录号为NR 116138.1，菌种保藏编号为GCMCC No.20155[20]。

1.2 玉米种子发芽实验

分别配制浓度为5、10、20、30、60 mg·L-1的NiCl2溶液和CdCl2溶液。挑选颗粒饱满、表皮无破损的玉米种子，用2%的NaClO溶液浸泡消毒10 min后，用去离子水清洗3遍，在28 ℃条件下，用不同浓度的NiCl2、CdCl2溶液中分别浸泡6 h后，均匀放入铺有滤纸的培养皿中，向皿内加入20 mL 相应浓度的NiCl2溶液和CdCl2溶液润湿滤纸，同时以去离子水作为对照处理。将培养皿移入温度28 ℃、湿度60%的人工气候箱中，避光培养72 h 后计算种子的发芽率，玉米种子露白0.5 mm记为已发芽。每个处理设置3次重复。

1.3 玉米幼苗水培实验

1.3.1 复合菌的制备

在28 ℃、160 r·min-1、振荡 24 h 的条件下利用牛肉膏蛋白胨培养基（NB）分别对菌株N4 和ZG2 进行活化和富集培养，将富集培养液按2%的比例接种至新鲜的牛肉膏蛋白胨培养基（NB）中在相同条件下培养。在4 ℃、8 000 r·min-1条件下，将培养后的菌株发酵液离心5 min，弃去上清液，用无菌水冲洗菌体细胞2 次再将其悬浮于无菌水中，得到OD600为0.3 左右的菌株N4 和ZG2 的单一菌悬液，最后将两种单一菌悬液按照1∶1的比例混合，即为制得的复合菌。

1.3.2 玉米幼苗水培实验

玉米种子经消毒清洗后，用去离子水浸种6 h 后均匀摆放于铺有湿润纱布的育苗盘中，移入智能人工气候箱（温度28 ℃、湿度60%、无光照）对种子进行催芽，出芽后取下纱布并恢复光照（光照强度2 000 lx），用去离子水将其培养至幼苗两叶一心时期。挑选长势一致的玉米幼苗，将其根部浸入制备的复合菌中，在160 r·min-1条件下振荡25 min 后作为复合菌处理，以无复合菌的处理作为对照处理，将幼苗移入装有300 mL Ni和Cd浓度分别为5、10、20、30、60 mg·L-1的Hoagland 营养液的塑料水培体系中，置于人工气候箱（温度25 ℃、湿度60%、光照强度2 000 lx、光照时间12 h）中开始水培实验，每个处理重复3 次（CK1、CK2、CK3分别表示Ni或Cd浓度为5、10、20 mg·L-1的对照处理；T1、T2、T3 分别表示 Ni 或 Cd 浓度为 5、10、20 mg·L-1的复合菌处理），培养14 d 后收获玉米幼苗样品，用去离子水洗净，吸干水分，测定并记录玉米幼苗的生长指标，再分别测定基于鲜质量时玉米幼苗的Ni 和 Cd 含量、Ni 和 Cd 亚细胞分布和形态分布、金属元素的含量。

为进一步研究外源Mg 对复合菌缓解玉米Ni 和Cd胁迫的影响，分别在Ni和Cd浓度为20 mg·L-1的胁迫下，设置了 3 种 Mg 浓度进行水培实验：0（-Mg）、0.5（Mg）、2.5 g·L-1（5Mg），参照上述实验步骤，对玉米幼苗根部接菌，同时以各浓度下不接菌的处理为对照，以相同条件培养14 d后收获样品并分别测定基于鲜质量时玉米幼苗的Ni、Cd和Mg含量。

1.4 测定方法

复合菌的生长数量用稀释涂布平板法进行测定[21]。

玉米幼苗的株高、主根长用直尺测定，玉米幼苗的干生物量用万分之一天平测定，玉米幼苗叶片的叶绿素值用SPAD-502Plus手持叶绿素仪测定。

玉米幼苗样品用CEM MARS6 微波消解仪进行消解，玉米幼苗叶片Ni 和Cd 亚细胞分布参照闫雷等[22]的方法进行分离和提取；玉米幼苗叶片不同形态的Ni和Cd参照改进的化学试剂逐步提取法[23]进行分离和提取。上述过程获得的溶液中Ni 和Cd 及各类元素的含量采用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS 7900）测定。

1.5 数据分析

不同处理数据的差异性分析采用SPSS23 中单因素ANOVA 检验，使用P<0.05 确定数据的差异显著性。相关性分析采用SPSS23 中双变量Pearson 检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 Ni和Cd对玉米种子发芽和玉米幼苗生长的毒性

不同浓度的Ni 和Cd 对玉米种子发芽率的影响如图1 所示。随着Ni 和Cd 浓度的升高，玉米种子发芽率显著降低。与对照相比，当Ni 浓度在5~60 mg·L-1时，玉米种子发芽率降低了26.1%~60.6%；当Cd浓度在5~60 mg·L-1时，玉米种子发芽率降低了24.6%~72.2%。这说明Ni 和Cd 胁迫会显著抑制玉米种子的正常萌发，并且较高浓度的Cd 对玉米种子萌发的抑制作用略大于Ni。

图1 Ni和Cd胁迫对玉米种子萌发的影响Figure 1 Effects of Ni and Cd stress on maize seed germination

另外，Ni和Cd的浓度越高，玉米幼苗受到的毒性越强。当Ni和Cd浓度在5~20 mg·L-1时，玉米幼苗长势均受到了显著影响，出现叶尖发黄的现象，且随着Ni和Cd浓度的增加，玉米幼苗长势逐渐减弱，部分叶片失绿坏死；当Ni和Cd浓度在30~60 mg·L-1时，玉米幼苗的长势完全被抑制，叶片皱缩卷曲坏死，玉米幼苗在24~36 h 内死亡。以上表明Ni 和Cd 胁迫对玉米幼苗具有毒性作用。

2.2 复合菌与玉米幼苗的共生

当Ni和Cd 浓度在 5~20 mg·L-1时，采集培养至不同时期的培养液测定复合菌的生长数量，结果如图2所示。在无玉米幼苗生长的培养液中（CK），复合菌无法维持生长繁殖，玉米幼苗水培时复合菌则能够进行生长繁殖，在无Ni 和Cd 胁迫下，菌落数量可达到2.08×109CFU·mL-1。Ni 胁迫下，复合菌的生长数量随着水培时间的增长而逐渐增加，在培养至第7 天达到最大值后复合菌的数量逐渐降低，培养至第14 天时复合菌的数量仍然可达到（14.2~21.0）×108CFU·mL-1；Cd 胁迫下，复合菌的生长数量随着水培时间的增长而缓慢增加，培养至第7 天时达到最大值，之后数量逐渐降低，培养至第14 天时复合菌的数量仍可达到（3.0~5.1）×108CFU·mL-1。有研究指出[24-25]，植物的根系分泌物可为微生物提供营养物质，吸引微生物聚集在植物根际定殖和生长，同时，微生物通过与植物根系的共生，与植物相互作用，发挥微生物的某些特定功能，如KOZDRÓJ 等[26]的研究表明，在重金属胁迫下，根系分泌物可使玉米根际土壤中某些植物促生菌的数量显著增长。这说明在玉米水培条件下，复合菌能利用玉米幼苗的根系分泌物进行生长繁殖，并且对Ni和Cd具有一定的抗性。

图2 Ni和Cd胁迫下复合菌的生长数量Figure 2 Growth of bacterial consortia under Ni and Cd stress

2.3 复合菌对玉米幼苗Ni和Cd胁迫的解毒特征

从图 3 可以看出，Ni 浓度为 5~20 mg·L-1时，与对照相比，复合菌使玉米幼苗的株高增加了11.6%~28.1%，使玉米幼苗的主根长增加了16.4%~19.0%，使玉米幼苗的干生物量增加了28.7%~33.8%，使玉米幼苗的叶绿素SPAD 值提高了13.5%~22.2%；Cd 浓度为5~20 mg·L-1时，与对照相比，复合菌使玉米幼苗的株高增加了18.9%~24.7%，使玉米幼苗的主根长增加了13.7%~19.2%，使玉米幼苗的干生物量增加了30.1%~31.1%，使玉米幼苗的叶绿素SPAD 值提高了17.0%~26.2%。这说明复合菌可能通过自身分泌IAA、铁载体等植物促生物质改变植物体内激素水平，促进重金属胁迫下作物的生长发育，从而增强作物对重金属的抗性[27-28]，或者通过固定重金属或促进重金属的形态转化，干扰作物对重金属的吸收和转化，从而降低重金属对作物的毒性[29-30]，进而明显缓解了Ni 和Cd 胁迫对玉米幼苗的毒性，促进了玉米幼苗植株的生长和根系的发育，缓解了Ni和Cd胁迫导致的损伤。

图3 Ni和Cd胁迫下复合菌对玉米幼苗生长的影响Figure 3 Effects of bacterial consortia on maize seedling growth under Ni and Cd stress

2.4 复合菌对玉米幼苗Ni和Cd胁迫的解毒机理

2.4.1 复合菌对玉米幼苗吸收Ni和Cd的影响

不同处理下，玉米幼苗各部位Ni 和Cd 的含量如图 4 所示。Ni 浓度为5、10、20 mg·L-1时，复合菌使玉米幼苗根部的Ni 含量分别比对照降低了15.1%、15.8%、21.7%，使玉米幼苗茎叶部的Ni含量分别比对照降低了 42.2%、37.0%、35.1%；Cd 浓度为 5、10、20 mg·L-1时，使玉米幼苗根部的Cd含量分别比对照降低了16.4%、15.1%、21.2%；使玉米幼苗茎叶部的Cd含量分别比对照降低了25.8%、27.2%、28.4%。

图4 复合菌对玉米幼苗Ni和Cd含量的影响Figure 4 Effects of bacterial consortia on Ni and Cd content in maize seedlings

2.4.2 复合菌对玉米幼苗叶片Ni 和Cd 形态分布和亚细胞分布的影响

如图5可知，Ni和Cd浓度为5~20 mg·L-1时，复合菌使玉米幼苗叶片内较高毒性形态（乙醇提取态和去离子水提取态）Ni 的分布比例之和较对照降低了13.9%~21.5%，使较低毒性形态（氯化钠提取态、醋酸提取态、盐酸提取态和残渣态）Ni 的分布比例之和增加了4.9%~12.1%；使玉米幼苗叶片中较高毒性形态Cd 的分布比例之和降低了14.7%~20.3%，使较低毒性形态Cd 的分布比例之和增加了4.2%~9.9%；使玉米幼苗叶片细胞器内Ni 的分布比例与对照相比降低了12.1%~17.0%，使玉米幼苗叶片细胞器内Cd 的分布比例降低了20.7%~29.3%。重金属在植物体内赋存形态和在亚细胞水平上的选择性分布能够反映重金属的生物毒性、迁移活性以及植物对重金属的耐受程度，因此，通过促进植物体内高毒性形态重金属向低毒性形态的转化，增强植物细胞内部对重金属进行隔离或转运的区隔化效应有利于减弱重金属对植物的生物毒性，已被认为是重金属毒害减弱的重要机理[31-33]。本研究结果表明，复合菌通过促使玉米幼苗叶片内Ni 和Cd 向低毒性、低迁移性的形态转化，增强了玉米幼苗叶片细胞壁对Ni 和Cd 的固持截留和叶片可溶性部分对Ni 和Cd 的螯合等过程，从而减弱了Ni 和Cd 在玉米体内的胁迫强度，降低了Ni 和Cd的生物毒性和有效性。

图5 复合菌对玉米幼苗叶片Ni和Cd形态分布和亚细胞分布的影响Figure 5 Effects of bacterial consortia on the morphological distribution and subcellular distribution of Ni and Cd in leaves of maize

2.4.3 复合菌对玉米幼苗茎叶部金属元素含量的影响

较高浓度的重金属能够减弱植物对营养元素的吸收能力，导致作物缺乏某些营养元素。对玉米幼苗茎叶部的Ca、Mg、Cu、Zn含量进行测定，结果如表1所示。随着Ni 和Cd 浓度的升高，玉米幼苗茎叶部的Ca、Mg、Cu、Zn 含量逐渐降低，说明 Ni 和 Cd 胁迫显著抑制了玉米幼苗对培养液中Ca、Mg、Cu、Zn 的吸收。但与对照相比，复合菌则能够明显增加玉米幼苗茎叶部Mg 的含量，对其他金属元素的含量无明显影响。相较于对照，Ni 浓度为5、10、20 mg·L-1时，复合菌处理玉米幼苗茎叶部Mg 的含量分别增加了21.0%、39.0%、24.1%；相较于对照，Cd 浓度为5、10、20 mg·L-1时，复合菌处理玉米幼苗茎叶部Mg 的含量分别增加了29.4%、11.4%、35.9%。有研究表明，某些具有特定功能的微生物可以通过提高植物对必需营养元素的吸收来改善植物对养分的获取，从而增强植物对重金属的抗性[34]。Mg 作为参与植物光合作用的必需金属元素之一，能够调节植物生长，并且Mg还与多种重金属离子存在竞争关系，能通过减少植物对重金属离子的吸收来提高其抵御重金属胁迫的能力，对受重金属胁迫的植物具有调控作用[35-37]。本研究表明在复合菌的作用下玉米幼苗通过吸收更多的Mg来降低其对Ni和Cd的吸收，从而降低了Ni和Cd的毒性。

表1 不同处理下玉米幼苗茎叶部金属元素的含量Table 1 Contents of metal elements in the aboveground of maize seedlings under different treatments

2.4.4 玉米幼苗茎叶部金属元素含量与Ni 和Cd 含量的相关性分析

由表2可知，玉米幼苗茎叶部Ni含量与Mg含量之间呈显著负相关（r=-0.874，P<0.05），与Zn 含量呈极显著负相关（r=-0.941，P<0.01）；玉米幼苗茎叶部Cd 含量与Mg 含量之间呈显著负相关（r=-0.914，P<0.05），与Zn含量之间呈显著负相关（r=-0.846，P<0.05）。

表2 玉米幼苗茎叶部金属元素含量与Ni和Cd含量的相关性分析（mg·kg-1）Table 2 Correlation analysis between the content of metal elements and the content of Ni and Cd in the shoots of maize seedlings（mg·kg-1）

2.4.5 Mg对玉米幼苗Ni和Cd胁迫的缓解作用

从图6 可以看出，复合菌促进了Ni 和Cd 胁迫浓度均为20 mg·L-1时玉米幼苗对培养液中Mg 的吸收，随着Mg 浓度的提高，复合菌进一步降低了玉米幼苗对 Ni 和 Cd 的吸收，增强了对 Mg 的吸收。Mg 浓度为0~2.5 g·L-1时复合菌可使玉米幼苗茎叶部Ni 的含量比对照降低了17.8%~38.2%，Mg 浓度为0.5~2.5 g·L-1的玉米幼苗茎叶部的Mg 含量比对照增加了33.7%~40.0%；Mg 浓度为0~2.5 g·L-1时复合菌可使玉米幼苗茎叶部Cd 的含量较对照降低了18.3%~31.6%，Mg 浓度为0.5~2.5 g·L-1时可使玉米幼苗茎叶部Mg 的含量较对照增加了26.5%~38.0%。这表明复合菌可通过提高对Mg的吸收来降低对Ni和Cd的吸收，增强对玉米幼苗Ni 和Cd 胁迫的解毒作用，这可能是由于复合菌产铁载体所介导的营养元素与重金属离子的竞争机制。如GUO 等[38]研究发现，Cd 胁迫下，利用具有铁载体分泌能力的菌株YL-6 显著促进了大豆叶片对Mg 的吸收，并显著降低了Cd 的含量。复合菌的这一作用机理仍有待进一步研究。