基于生物打印技术的间接共培养体系的构建

毕效铭，王 雯,2，高 茜，袁长永,3

三维打印是一种以数字程序为基础，通过逐层打印的方式来构造物体的技术，被广泛应用于颌面部修复、关节和骨盆手术、器官再造等方面[1]。同时，在数字化正畸、数字化种植、颌骨重建等口腔领域，三维打印也发挥着重要作用[2]。三维生物打印是三维打印的一个分支，它以负载细胞的生物墨水为原料，按预设的路径打印结构，在牙再生[3]、皮肤修复[4]、成骨[5]、成软骨[6]、组织工程[7]等领域均有巨大的发展前景。

甲基丙烯酰化明胶(GelMA胶)是一种水凝胶材料，细胞相容性和组织相容性良好，且具有一定的机械强度，是理想的生物墨水材料[8]。牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一种间充质干细胞，在一定诱导条件下可以成骨和成血管[9-10]，具有多向分化潜能和神经血管特性[11]。人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells， HUVECs)具有一定的干细胞潜能，是一种常用的细胞模型。

目前存在的共培养体系大多是体外共培养。本实验计划利用生物打印技术，以GelMA30胶为原料，构建新型间接共培养体系。若实验成功，将为后期检测共培养体系下干细胞的成骨和成血管能力，建立既可以应用于体外、也能够体内移植的间接共培养体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

α-MEM培养基(Gibco，美国)，ECM培养基(ScienCell，美国)，胎牛血清(天杭生物，湖州)，胰酶细胞消化液、青霉素-链霉素溶液、4%多聚甲醛溶液(微科曼得，徐州)，1×PBS、1×D-PBS(凯基生物，中国)，GelMA30水凝胶(EFL产业化公司，苏州)，Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(碧云天，上海),HUVECs(中乔新舟，上海)，DPSCs自行分离培养并经形态学鉴定。

三维打印机(Regenovo Bio-Architect®，捷诺飞，中国)，Stellaris 5超高分辨激光共聚焦显微镜(徕卡，德国)，BX43研究级正置荧光显微镜(Olympus，中国)。

1.2 配制GelMA溶液

1.2.1 配制0.25%引发剂 避光条件下，取GelMA30试剂盒中的光引发剂LAP 0.05 g，加入20 mL PBS，40～50 ℃水浴加热15 min，持续振荡，直至LAP完全溶解。

1.2.2 配制5% GelMA30 取1 g GelMA30胶置于50 mL离心管内，加入20 mL引发剂，37 ℃水浴锅内避光加热20～30 min并持续振荡，直至GelMA30胶完全溶解。将配好的GelMA30胶过滤灭菌。

1.3 出丝测试和可打印性测试

控制室温23 ℃，出丝速度5 mm/s，压强0.04～0.08 MPa。将配制好的GelMA30胶置于4 ℃摇床上，孵育20 min，再置于一定温度的喷头上孵育20 min，然后出丝。低温喷头分别控温15、17、19、21、23、25 ℃，检测不同温度下的出丝情况，由此确定喷头的最适温度为21～23 ℃。

在最适温度下，打印一根连续不间断的丝，置于间隔分别为1、2、3、4、5、6 mm的支架上，观察丝的塌陷程度并测量丝的下垂距离。

配制GelMA30胶，置于5 mL光固化料筒中，4 ℃摇床孵育20 min。预设三维打印机的参数，平台控温5 ℃，低温喷头控温21 ℃，室温控制23 ℃；构建圆形网格状模型，每层0.2 mm，共5层，断丝抬高1 mm，两丝间距1 mm。将料筒从摇床转移至低温喷头上，控温20 min。试出丝，出丝速度5 mm/s。待出丝顺畅后，按预设路径开始打印。打印完成后光固化2次，每次20 s。在正置荧光显微镜下拍摄上层、中层、下层的孔隙照片，用Image J分别测量孔隙的周长(L)和面积(A)，运用公式计算模型的可打印性(printability，Pr)[12]。

1.4 细胞活死检测

1.4.1 DPSCs活死检测 在三维打印机上构建同心圆模型，直径8 mm，每圈间隔1 mm，共7圈，如图1所示。每层高0.2 mm，共5层，总层高1.0 mm。

图1 同心圆模型路径图

以10% MEM培养基代替PBS配制GelMA30胶。在无菌环境下，将1 mL 5% GelMA30与2×106个DPSCs混合均匀，置于5 mL光固化料筒中，4 ℃摇床孵育20 min，低温喷头控温20 min。出丝顺畅后，按预设路径开始打印。所有模型均打印在60 mm培养皿中。

打印完成后，光固化2次，每次20 s。24孔板中加入1 mL 10% MEM培养基，用无菌镊子将模型转移至培养基中，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。使用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒进行活死染色。避光条件下，向1 mL染色缓冲液中加入10 μL Calcein AM和10 μL PI配制染色剂。于模型培养的第1天和第7天，吸弃24孔板中的培养基，加入PBS冲洗3次，吸弃PBS，加入0.5 mL染色液，使其覆盖模型。避光条件下，将24孔板移入培养箱内培养45 min。染色结束后，PBS冲洗模型3次并吸弃。用激光共聚焦显微镜观察活死情况，计算细胞存活率。

1.4.2 HUVECs活死检测 以10% ECM培养基代替PBS配制GelMA30胶。将1 mL 5% GelMA30与2×106个HUVECs混匀，打印同心圆结构，打印参数和方法同上。在24孔板内加入1 mL ECM培养基，移入固化后的模型，放入培养箱培养。在第1天和第7天，活死染色45 min，D-PBS反复冲洗后，用激光共聚焦显微镜观察，并计算细胞存活率。

1.5 构建共培养模型

1.5.1 构建DPSCs-HUVECs直接共培养模型(M组) 用1∶1混合的MEM培养基和ECM培养基代替PBS配制GelMA30胶。将1 mL GelMA30胶与2×106个增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein, EGFP)基因转染的DPSCs细胞(EGFP-DPSCs)和2×106个负载表达mCherry质粒的慢病毒转染HUVECs细胞(mCherry-HUVECs)混合均匀(细胞总密度为4×106个/mL)，置于5 mL料筒中，4 ℃摇床孵育20 min，移至21 ℃控温喷头控温20 min，打印同心圆模型并进行光固化。24孔板内加入MEM培养基与ECM培养基各500 μL，混合均匀后将模型移入。

1.5.2 构建单纯DPSCs培养模型(D-D200组) 以不含细胞的GelMA30胶作为间隔物，将含细胞的胶分隔开，此时DPSCs的间距为200 μm。用MEM培养基代替PBS配制GelMA30胶。将1 mL GelMA30胶与4×106个EGFP-DPSCs混合，打印D-D200模型并固化。24孔板内加入1 mL MEM培养基，移入模型。

1.5.3 构建单纯HUVECs培养模型(H-D200组) 使用mCherry-HUVECs和ECM培养基，步骤同1.5.2，构建间距为200 μm的单纯HUVECs培养模型。

1.5.4 构建DPSCs-HUVECs间接共培养模型(M-D0组) 分别配制细胞密度为4×106个/mL的EGFP-DPSCs和mCherry-HUVECs的GelMA30胶，步骤同上。将两个料筒分别置于2号、3号低温喷头，使其交替打印同心圆结构，并进行光固化。24孔板内加入MEM与ECM各500 μL，混合均匀后将模型移入。

1.5.5 构建DPSCs-GelMA30胶-HUVECs模型(M-D200组) 配制细胞密度为4×106个/mL的EGFP-DPSCs胶、4×106个/mL的mCherry-HUVECs胶和不含细胞的GelMA30胶。以不含细胞的GelMA30胶作为间隔物，间距为200 μm。将三个料筒置于2号、3号、4号低温枪头，交替打印同心圆结构，并进行光固化。24孔板内加入MEM与ECM各500 μL，移入模型。

1.5.6 构建DPSCs-GelMA30胶-HUVECs模型(M-D400组) 步骤同1.5.5，打印间距更改为400 μm。

以上6种模型均在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，使用激光共聚焦显微镜观察荧光细胞分布情况并拍照。

2 结 果

2.1 出丝试验和打印参数

低温喷头控温15～19 ℃时，出丝粗糙，有颗粒感；21～23 ℃时，出丝连贯顺滑；>25 ℃时，出丝呈液滴状(图2)。因此，低温喷头宜控温21～23 ℃。打印参数见1.3部分。

图2 不同温度下的出丝状况

2.2 可打印性测试

出丝塌陷试验：出丝可顺利悬挂在支架上而不发生明显塌陷，下垂距离为0.2 mm，证明5% GelMA30胶有一定的支持强度(图3)。打印圆形网格状模型：根据孔隙的面积和周长计算出Pr平均值为0.97±0.02。综上，证明5% GelMA30胶具有良好的可打印性。

图3 出丝塌陷试验

2.3 DPSCs和HUVECs细胞存活率

细胞存活率=活细胞数/总细胞数×100%。在5%的GelMA中，细胞存活状况良好(图4)，并可以进一步伸展(图5)。具体结果见表1。

图4 DPSCs与HUVECs活死染色平面图( ×40)

图5 DPSCs与HUVECs活死染色三维空间图( ×40)

表1 DPSCs与HUVECs活细胞率

2.4 6种同心圆共培养体系的构建

6种共培养体系的三维打印模型、三维打印路径和激光共聚焦显微镜下照片见图6。实验结果表明，可以顺利打印出6种预期的模型结构。

图6 同心圆共培养模型

3 讨 论

随着牙髓再生(regenerative endodontic procedures，REPs)技术的进一步发展，共培养体系逐渐成为近些年的研究热点[13]。Liu等[14]的实验结果表明，HUVECs培养液可以影响DPSCs的分化。吴一梦等[15]发现，在牙本质提取液中，HUVECs与DPSCs共培养，可促进DPSCs成血管并向成牙本质细胞分化。提示HUVECs可通过共培养促进DPSCs的各向分化，从而恢复牙髓的部分功能。Dissanayaka等[16]发现，共培养条件下，DPSCs不仅可以增加血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，还能促进HUVECs的迁移，进而促进早期血管网的形成。安莉等[17]的研究表明，HUVECs与DPSCs共培养可以促进体外血管再生。因此，负载DPSCs和HUVECs的GelMA水凝胶可用于临床牙髓血运重建治疗[18]。本实验以加入DPSCs和HUVECs的5% GelMA30作为生物墨水，成功打印出同心圆状间接共培养结构，为共培养提供了全新的打印模板。

本实验旨在为构建体内外均可应用的共培养体系奠定基础，为共培养体系的口腔应用提供新思路。后续可在不同共培养环境中，研究同心圆模型成骨、成牙本质、成血管潜能，以期构建可用于REPs的共培养体系；也可将该共培养体系与不同种类的支架材料相结合[19]，构建出功能完整、更多样化的牙髓支架[20]；还可将这种共培养体系植入动物体内，观察其REPs的效果。将DPSCs植入外伤的年轻恒牙的治疗已有成效[21]，共培养体系的体内应用也有望实现。此外，还可以拓宽生物打印的应用范围，推动生物打印与口腔领域、组织细胞培养等多个领域的融会贯通。