二氧化钛纳米颗粒对玉米幼苗吸收镉及其植物毒性的影响

2022-12-01郑泽其李剑涛吴佳妮连加攀史瑞滢刘维涛

农业资源与环境学报 2022年6期

郑泽其，李剑涛，吴佳妮，连加攀，史瑞滢，刘维涛

（南开大学环境科学与工程学院污染过程与基准教育部重点实验室/天津市城市环境污染诊断与修复技术工程中心，天津 300350）

土壤是农业生产和人类生存的重要物质基础，然而随着工农业的快速发展，农田土壤中的重金属污染日益严重[1]。重金属镉（Cd）具有溶解度高、移动性强、半衰期长等特点，被认为是毒性最大的重金属之一[2]。2014 年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，Cd的点位超标率高达7.0%，位居所调查的污染物之首，严重污染程度点位的比例高达0.5%[3]。Cd能降低植物体内的光合色素，影响植物的细胞周期和分裂，甚至会导致植物染色体发生畸变[4]，并可通过食物链传递，对动物和人体的健康构成极大威胁[5]。因此，土壤Cd污染的修复和治理迫在眉睫。

纳米颗粒（NPs）被定义为至少在一个维度上小于100 nm 的颗粒，其具有比表面积大和表面能高等特点[6]。其中，二氧化钛纳米颗粒（TiO2NPs）是应用最广泛的NPs 之一，主要应用于食品添加剂、油漆、个人护理品、化妆品、太阳能电池、生物传感器等生产过程中[7-8]。据报道，TiO2NPs 的年生产量可达88 000 t，全球释放进入环境中的TiO2NPs超过纳米材料总量的1/4[9]，其中13.8%的TiO2NPs进入土壤环境[10]。

目前，国内外众多学者已开展了TiO2NPs与植物的交互作用研究[7]。TiO2NPs 对植物的生长具有正面或负面效应，这取决于植物品种、暴露浓度、暴露途径和粒径大小[11]。已有研究证实，随着TiO2NPs 浓度的增加，烟草（Nicotiana tabacum）幼苗的生长和发育水平显著降低[12]。TiO2NPs 也会对萝卜（Raphanus sativus）根尖造成严重的DNA 损伤[13]。但亦有研究表明TiO2NPs 显著提高菠菜（Spinacia oleracea）硝酸还原酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶的活性，促进菠菜的氮代谢[14]。

近年来，利用NPs促进污染土壤植物修复的研究方兴未艾[15]。NPs 可以直接去除污染物，促进植物生长，提高污染物的植物有效性，从而在植物修复系统中发挥作用[7-8]。TiO2NPs 根暴露可以降低Cd 在水稻（Oryza sativa）根和叶中的吸收、分布，降低Cd 对水稻的毒性[16]。本课题组前期的水培试验研究[11]表明，TiO2NPs 叶暴露可有效地缓解Cd 对玉米（Zea mays）的毒性，降低Cd 在玉米中的积累；而TiO2NPs 根暴露则促进了玉米对Cd 的吸收。然而，水培环境与真实土壤环境相差甚远，TiO2NPs 根暴露是否可以有效促进玉米修复土壤中的Cd 污染仍未可知。因此，在前期研究基础上，为进一步探究根部施用TiO2NPs强化玉米修复Cd 污染土壤的可行性，本研究特开展了土壤盆栽试验，通过对玉米生长指标、生理生化特性、玉米地上部和根系的Cd 含量、整株Cd 提取量以及Cd转运系数等进行分析，探讨不同浓度TiO2NPs在根部施用对玉米吸收和积累Cd及Cd毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验于2020年5—7月在南开大学津南校区环境科学与工程学院（38°59′15.49″N，117°19′53.08″E）开展。供试土样采自南开大学津南校区西北门附近绿地，土壤类型为棕壤，待土样自然风干后过2 mm筛以去除土壤中的杂质。土壤的基本理化性质：pH 值7.51，有机质含量1.453%，总氮、总磷和总钾含量分别为1.355、1.180 g·kg-1和1.025 g·kg-1，有效磷含量120 mg·kg-1，有效钾含量415.67 mg·kg-1，阳离子交换量（CEC）13.86 cmol·kg-1，Cd含量0.11 mg·kg-1。

TiO2NPs（纯度：99.8%，5～10 nm，锐钛）购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，TiO2NPs 的平均粒径为（6.5±0.76）nm，比表面积为264.8 m2·g-1。将添加于土样中的TiO2NPs 超声振荡30 min，制备成TiO2NPs悬浮液，备用。供试作物为玉米（Zea maysL.cv ND488），购自天津市津南区种子公司。

1.2 试验方法

选取大小均匀、颗粒饱满的玉米种子浸泡于3%的H2O2溶液中消毒10 min。随后将玉米种子用蒸馏水淋洗3次，以去除种子表面残留的H2O2溶液。用蒸馏水将种子浸泡30 min，使种子膨胀软化。最后，将种子播种于装有1 kg 过筛风干土的塑料盆中。每隔3 d定时定量浇水。在幼苗出齐后，进行第一次间苗；待幼苗长至3～4 片真叶时，进行第二次间苗。最终，每盆保留5株幼苗（图1）。

图1 土培试验Figure 1 Soil culture experiment

试验共设12 个处理，用不同浓度的CdCl2·2.5H2O 和TiO2NPs 染毒（表1），将其以溶液形式拌入1 kg土壤后装盆，平衡4周，每个处理3次重复。将玉米幼苗于温室（温度28 ℃，相对湿度50%～80%，光照强度2 300 lx）中培养一个月。其间，每日光照时间为8：00—19：00，共11 h。定期改变各个塑料盆的位置，从而排除环境差异引起的误差。土培试验处理组设计如表1所示。

表1 土培试验中Cd和TiO2 NPs的浓度设置Table 1 Concentrations of Cd and TiO2 NPs in pot-culture experiment

1.3 测试方法

生长指标测定：培养结束时测定玉米的株高和根长；将玉米于103 ℃烘箱内烘干至恒质量后，分别用电子天平称量各组幼苗的鲜质量和干质量。

叶绿素提取与测定：参照李得孝等[17]的方法，幼苗生长至2～3 叶期剪取叶片并剪成2 mm 碎条，一半装入塑料袋放于冰箱中冷冻，另一半在室温下称取0.2 g植物鲜样，用研磨法（80%丙酮与95%乙醇）和直接浸提法（6种提取液）提取叶绿素。每种方法设3个重复，每次重复取样200 mg左右。样品研磨后用滤纸过滤（洗涤定容25 mL），在645 nm和663 nm波长下测定吸光值。浸提法在黑暗中进行，并不时摇动，约14 h后定容测定吸光值，放置4 h后再测定一次吸光值。

抗氧化酶液提取与测定[18]：称取0.1 g植物新鲜叶片，加4 mL 预冷的100 mmol·L-1PBS 缓冲液[pH 7.0，含0.1 mmol·L-1EDTA 和1%（m/V）PVP]，冰浴研磨。匀浆液于4 ℃、15 000g下离心15 min。所得上清液即为待测酶的粗提液。丙二醛（MDA）的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，超氧化物歧化酶（SOD）的测定采用氮蓝四唑（NBT）法，抗坏血酸过氧化物酶（APX）的测定采用抗坏血酸氧化反应法，过氧化物酶（POD）的测定采用愈创木酚法。

参照LIU 等[4-5]的方法，将干燥的植物样品磨成粉末，过0.149 mm 孔径筛。植物粉末（0.50 g）用含有87%浓缩HNO3和13%浓缩HCLO4（V/V）的12 mL 溶液在微波消解仪（SINEO MDS-6G）中消解。采用原子吸收分光光度计（AAS，Hitachi 180-80）测定消解液中Cd含量。

Cd提取量是衡量TiO2NPs强化植物修复Cd污染的重要指标[4]，计算公式如下：

式中：CCd为玉米中Cd 的含量，mg·kg-1（以干质量计）；mDW为每株玉米的干质量，g·株-1。

转运系数（Translocation factor，TF）可用于评估植物将重金属从根部转移至地上部的能力[2]，是指植物地上部Cd 含量与地下部Cd 含量的比值，计算公式如下：

式中：Cshoot和Croot分别为玉米地上部和根部的Cd含量。

1.4 数据分析

所有数据均重复检测3 次，采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 16.0 对测得数据进行计算、处理与统计分析，利用LSD（Least significant difference）对数据进行显著性检验，并用Origin 9.0制图。

2 结果与分析

2.1 添加TiO2 NPs和Cd对玉米生长的影响

与对照（CK）相比，单一TiO2NPs或Cd处理，亦或二者联合处理对玉米的株高（图2A）和根长（图2B）均无显著影响（P＞0.05）。TiO2NPs 单一处理对玉米的鲜质量（图2C）和干质量（图2D）也无显著影响（P＞0.05）。当TiO2NPs 处理浓度为200 mg·kg-1时，相比于对照组，玉米幼苗的鲜质量升高了22.61%（图2C）。Cd 胁迫对玉米幼苗的生物量具有一定的抑制作用。Cd 单一暴露条件下，随着Cd 浓度的升高，玉米幼苗的鲜质量降低，在Cd 最高浓度（50 mg·kg-1）时，鲜质量降低了20.35%（图2C）。与鲜质量类似，玉米幼苗干质量随着Cd 浓度的增加而降低，当Cd 暴露浓度为10 mg·kg-1和50 mg·kg-1时，玉米幼苗干质量分别显著（P＜0.05）降低了29.14%和33.42%（图2D）。

TiO2NPs 的施用在一定程度上降低了Cd 对玉米的植物毒性，主要表现在TiO2NPs 对Cd 胁迫引起的玉米幼苗生物量的降低具有缓解作用。当Cd胁迫浓度为10 mg·kg-1时，施用50 mg·kg-1和200 mg·kg-1的TiO2NPs 可使玉米幼苗干质量明显增加27.40%和34.77%；当Cd 胁迫浓度为50 mg·kg-1，施用TiO2NPs浓度为50 mg·kg-1和200 mg·kg-1时，玉米幼苗的干质量分别增加了27.09%和35.34%（图2D），表明施用TiO2NPs 对玉米幼苗的鲜质量和干质量具有一定的提升作用。

图2 不同处理玉米的株高（A）、根长（B）、鲜质量（C）和干质量（D）Figure 2 Plant height（A），root length（B），fresh weight（C）and dry weight（D）of maize under different treatments

2.2 TiO2 NPs和Cd对玉米叶绿素含量的影响

Cd 胁迫对玉米幼苗的叶绿素造成破坏，降低了叶绿素的含量，影响植物进行光合作用。单一Cd 暴露情况下，随着Cd 浓度的增加，叶绿素a（图3A）和叶绿素b（图3B）的含量均随之降低。当Cd 的浓度为50 mg·kg-1时，相比于对照组，玉米幼苗的叶绿素a 和叶绿素b 含量分别显著（P＜0.05）下降36.64% 和32.72%。而单一TiO2NPs添加时，玉米幼苗的叶绿素含量均高于对照组。当TiO2NPs 的浓度为200 mg·kg-1时，相比于对照组，玉米幼苗的叶绿素a 含量显著（P＜0.05）增加了18.40%，而叶绿素b 含量增加了9.46%。此外，在TiO2NPs 和Cd 联合暴露情况下，Cd浓度为2 mg·kg-1时，外源添加200 mg·kg-1TiO2NPs使玉米幼苗的叶绿素a 和叶绿素b 含量分别增加7.88%和12.14%。在Cd 浓度为50 mg·kg-1时，外源添加200 mg·kg-1TiO2NPs可使玉米幼苗的叶绿素a和叶绿素b含量分别显著（P＜0.05）增加42.48%和35.55%。由此可见，TiO2NPs 可促进玉米幼苗叶绿素的形成，提高其光合作用效率。

图3 不同处理玉米叶绿素a（A）和叶绿素b（B）的含量Figure 3 Contents of chlorophyll a（A）and chlorophyll b（B）in maize under different treatments

2.3 TiO2 NPs 对Cd 胁迫下玉米氧化损伤和抗氧化酶活性的影响

Cd 可以通过干扰PSⅠ和PSⅡ途径中的电子传递链、置换酶类物质的活性中心、破坏细胞内氧化还原平衡等，导致活性氧的产生[19]。过量的活性氧积累会引起细胞膜脂质过氧化，对植物造成过氧化损伤。MDA 是脂质过氧化过程的主要终产物之一，通常利用它作为脂质过氧化指标[20]。如图4A 所示，Cd 胁迫下玉米幼苗的MDA 含量升高。当Cd 的浓度为50 mg·kg-1时，相比于对照组，玉米幼苗的MDA 含量显著（P＜0.05）升高了112.72%。类似地，在单施TiO2NPs 处理中随着TiO2NPs 浓度的升高，玉米幼苗的MDA 含量也逐渐上升，但变化不显著。在共同添加Cd 和TiO2NPs 的处理组中，玉米幼苗的MDA 含量均随着TiO2NPs 浓度的增加而下降。当Cd 浓度为50 mg·kg-1时，添加50 mg·kg-1和200 mg·kg-1TiO2NPs 的玉米幼苗MDA 含量分别下降了10.52%、24.15%。

图4 不同处理玉米幼苗的MDA含量（A）以及SOD（B）、APX（C）、POD（D）活性Figure 4 MDA contents（A）and SOD（B），APX（C），POD（D）activities of maize seedlings under different treatments

与对照组相比，Cd 胁迫下三种抗氧化酶的活性均增强，10 mg·kg-1和50 mg·kg-1Cd 胁迫分别使玉米幼苗的SOD 活性显著提高了62.25%、72.65%（图4B）；10 mg·kg-1Cd 处理使APX 的活性提高了32.46%（图4C）；50 mg·kg-1Cd 胁迫使POD 的活性提高了46.02%（图4D）。TiO2NPs 的添加在一定程度上可以提高玉米SOD、APX、POD 的活性。在Cd 和TiO2NPs共同暴露下，随着TiO2NPs 浓度的增加，SOD、APX、POD 的活性均逐渐增强，但TiO2NPs 对Cd 胁迫下玉米幼苗的SOD 和APX 活性的影响不显著。当Cd 浓度分别为10 mg·kg-1和50 mg·kg-1时，200 mg·kg-1TiO2NPs处理导致玉米幼苗的POD活性分别显著（P＜0.05）提高了47.91%和44.23%。

2.4 TiO2 NPs对玉米吸收和转运Cd的影响

玉米幼苗对重金属Cd 的吸收是一个复杂的过程，Cd 先通过植物根系组织的质膜横向运输，再由木质部运输到地上部[21]。如图5所示，随着Cd浓度的增加，玉米幼苗的地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量均逐渐增加。当Cd的浓度为50 mg·kg-1时，玉米幼苗地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量分别为Cd 浓度2 mg·kg-1时的5.17、11.00、5.43 倍。当Cd 的浓度从2 mg·kg-1上升到50 mg·kg-1时，玉米幼苗的转运系数显著下降了40.84%（图5C）。

当土壤中Cd 浓度为10 mg·kg-1时，外源施用TiO2NPs提升了玉米地上部（图5A）和根部（图5B）Cd含量。尤其是当土壤Cd 为10 mg·kg-1时，50 mg·kg-1TiO2NPs显著（P＜0.05）提高了地上部Cd含量。TiO2NPs可促进Cd 在玉米幼苗中的转运以及玉米对Cd 的提取。当Cd 处理浓度为10 mg·kg-1时，50 mg·kg-1TiO2NPs 处理显著（P＜0.05）提高了Cd 的转运系数（图5C）和提取量（图5D）。

图5 不同处理玉米幼苗地上部（A）、根部（B）Cd含量以及Cd的转运系数（C）和提取量（D）Figure 5 Cd content in shoots（A）and roots（B），translocation factor（C）and Cd extraction quantity（D）of maize seedlings under different treatments

3 讨论

研究表明，植物受重金属Cd 毒害的主要症状表现为植株矮小、发育迟缓、萎蔫枯黄[2，4-5]。本研究发现与单一Cd 胁迫相比，加入TiO2NPs 在一定程度上减少了Cd对玉米的氧化损伤，提升了玉米干质量、鲜质量、叶绿素含量及抗氧化酶活性，表明TiO2NPs 的施用可缓解Cd 对玉米植株的毒害作用。SINGH 等[22]也发现，Cd（50、100、150 mg·kg-1）暴露降低了大豆（Glycine max）的干质量和鲜质量，而TiO2NPs 的施用提高了大豆的生物量，缓解了Cd对大豆的植物毒性。GONG 等[23]的研究也表明，500 mg·kg-1多层碳纳米管（MWCNTs）处理促进了苎麻（Boehmeria nivea）幼苗生长，缓解了Cd的植物毒性。

TiO2NPs 的暴露途径可对Cd 的植物毒性及其在植物中的吸收产生影响。本课题组前期的水培试验表明，TiO2NPs 的叶面暴露可以有效地缓解Cd 对玉米的毒性，降低Cd在玉米中的积累，但根暴露却促进了玉米对Cd 的吸收[11]。本研究进一步证实，在土培条件下，TiO2NPs 根暴露可促进玉米植株对Cd 吸收，并显著提高了玉米幼苗的叶绿素含量。类似地，SINGH 等[22]研究证实TiO2NPs 通过提高植物的光合速率和生长参数来抑制Cd 毒性。RALIYA 等[24]和SERVIN 等[25]也发现，TiO2NPs 处理可以提高西红柿（Solanum lycopersicum）和黄瓜（Cucumis sativus）的叶绿素含量。此外，JI 等[26]的研究表明TiO2NPs 提高了Cd胁迫下水稻的净光合速率和叶绿素含量。

抗氧化酶体系是植物细胞本身具有的抵御氧化损伤的系统，植物受到重金属胁迫时，抗氧化酶系统响应是其重要的耐性机制[19]。在逆境条件下，抗氧化酶的活性会增强，以清除细胞中积累的活性氧，维持组织中的氧化还原平衡[27]。超氧化物歧化酶（SOD）能清除超氧阴离子自由基，通过歧化反应将O-2·转化为H2O2和O2，产生的H2O2可进一步在过氧化物酶（POD）的催化下降解为完全无毒害的H2O[28]。抗坏血酸过氧化物酶（APX）既是利用抗坏血酸（AsA）作为电子供体的H2O2清除酶，又是维生素C代谢的主要酶类。本研究中SOD、APX、POD 三种抗氧化酶的活性变化趋势基本一致，其与MDA 的含量变化相一致。这可能是由于TiO2NPs 通过改善抗氧化酶的活性来抑制玉米幼苗内活性氧的积累，使得MDA 的含量下降，减轻Cd 对玉米幼苗的毒害作用。TiO2NPs 能在一定程度上缓解Cd 胁迫对玉米幼苗造成的氧化损伤。这与JI 等[26]对水稻幼苗中MDA 含量变化的研究结果一致。类似地研究也发现，TiO2NPs 能提高油菜（Brassica napus）[29]、西红柿（Lycopersicon esculentum）[30]和菠菜（Spinacia oleracea）[31]的光合作用参数和抗氧化系统活性。

本研究发现随着Cd 胁迫浓度逐渐提高，玉米幼苗的地上部、根部Cd 含量以及Cd 提取量均逐渐增加。SHAH 等[32]也发现水稻幼苗的地上部与根部Cd含量随着Cd 浓度的增加而增加。整体而言，转运系数随着Cd 浓度的增加呈现下降的趋势，这与本课题组之前的研究结果[2，5，33]一致。外源施用TiO2NPs 影响植物吸收Cd 的可能机理是：TiO2NPs 能提高叶绿体类囊体膜上Mg2+-ATPase 的活性[34]，根系释放质子的通道则随着质膜H+-ATPase 的激活而被激活，植物根系开始分泌质子并在根际形成酸性条件，从而增加了土壤Cd的植物有效性[35]。此外，TiO2NPs易形成团聚体并吸附土壤中的重金属，从而降低了土壤中重金属的植物有效性，可能也是TiO2NPs抑制植物吸收重金属和缓解重金属植物毒性的机理之一[36]。本研究还发现，尽管高Cd（50 mg·kg-1）处理下，TiO2NPs的外源施用降低了地上部和根部的Cd 含量，但玉米幼苗的Cd 提取量却有所增加（图5D），可能是由于TiO2NPs 的施用提高了玉米幼苗的生物量（图2C 和图2D）。