电刺激调控骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化作用及机制研究

陈艳梅，刘琦石，王莉辉，张 哲，余咏宜

女性盆底功能障碍性疾病是常见的妇产科疾病，孕期及分娩引起盆底支持组织损伤是主要病因；组织学特征是盆底支持组织中平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC）凋亡、胶原减少[1，2]。目前尚缺乏有效的治疗手段。近些年，成体干细胞移植是受到越来越多关注的组织工程治疗手段，在女性盆底功能障碍性疾病的治疗中展现出积极应用前景[3]。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是来源广泛的成体干细胞之一，具有取材方便、自我更新、多向分化等特点，是用于组织工程治疗理想的种子细胞。

盆底神经肌肉电刺激是治疗盆底功能障碍性疾病的常用方式之一，新近有研究证实电刺激对干细胞的分化具有促进作用。根据Dong ZY的细胞实验结果，电刺激通过磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路促进神经元干细胞向神经元分化[4]。在SMC分化的过程中，PI3K/Akt通路、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路起重要的调控作用[5]，但电刺激对干细胞向SMC分化的调控作用及机制尚不清楚。笔者以PI3K/Akt通路及ERK通路为切入点，通过细胞实验探究电刺激调控BMSC向SMC分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

成年雄性SD大鼠5只，鼠龄8～10周，平均鼠龄9.12周（标准差0.28周）；体质量180～200 g。由上海杰思捷实验动物有限公司提供，生产许可证SCXK（沪）2018-0004。

1.1.2 主要试剂

PI3K抑制剂LY294002（简称LY）、ERK抑制剂PD98059（简称PD）（MCE，美国）；四唑化合物即3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑内盐[（3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt，MTS]细胞增殖检测试剂盒（Promega，美国）；CD44、CD29、CD45、CD34一抗（BD，美国）；平滑肌α肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重链（smooth muscle-myosin heavy chain，SM-MHC）、钙调节蛋白（calpoin）一抗（Abcam，美国）；PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗（CST，美国）。

1.1.3 主要仪器

细胞电刺激装置（型号microcontrol。北京久易科仪科技公司，中国）；细胞培养箱（型号Form311。Thermo，美国）；流式细胞仪（型号CytoFlex。Beckman Coulter，美国）；凝胶成像系统（型号XRS。Bio-rad，美国）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养

取大鼠胫骨及股骨的骨髓，采用干细胞分离液分离BMSC；在含有10%胎牛血清的达氏改良伊氏培养液（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）中原代培养，每2～3 d更换1次培养液；待细胞汇合至70%时进行胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例传代继续培养。

1.2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定

取第3代BMSC，制备成密度5×105/mL细胞悬液；将200μL细胞悬液加入1.5 mL离心管内，分别加入2μL CD44、CD29、CD45、CD34抗体，于4℃避光条件下孵育1 h。在流式细胞仪上检测CD44、CD29、CD45、CD34的表达情况。

1.2.3 骨髓间充质干细胞的分组与干预

取第3代BMSC进行分组，即对照组、电刺激组、溶剂对照组、溶剂+电刺激组、LY+电刺激组、PD+电刺激组、si-NC组、si-NC+电刺激组、si-PI3K+电刺激组、si-ERK+电刺激组。每组重复5次。

对照组在DMEM中进行干预，连续10 d；电刺激组参照唐敏等[6]的研究给予电压2 V、频率2 Hz、脉宽5 ms的电刺激干预，2 h/d，连续10 d；溶剂对照组在含有0.1%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM中进行干预，连续10 d；溶剂+电刺激组在含有0.1%DMSO的DMEM中进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d；LY+电刺激组在含有20μmol/L LY294002[7]的DMEM中进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d；PD+电刺激组在含有50μmol/L PD98059[8]的DMEM中进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d；si-NC组转染NC siRNA，6 h后更换为DMEM并继续培养10 d；si-NC+电刺激组转染NC siRNA，6 h后更换为DMEM并进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d；si-PI3K+电刺激组转染PI3K siRNA，6 h后更换为DMEM并进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d；si-ERK+电刺激组转染ERK siRNA，6 h后更换为DMEM并进行电刺激（条件同电刺激组），连续10 d。

1.2.4 骨髓间充质干细胞增殖活力的检测

取干预后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天时对照组和电刺激组BMSC，采用MTS法细胞增殖检测试剂盒进行实验。按照试剂盒说明书进行操作并在酶标仪上检测450 nm波长的光密度（optical density，OD）450值。

1.2.5 骨髓间充质干细胞中平滑肌细胞标志蛋白及信号通路蛋白的检测

取干预后第10天时对照组和电刺激组BMSC，采用细胞裂解液对BMSC进行裂解，提取BMSC中的蛋白；检测蛋白浓度后，将含有20μg蛋白的样本加入十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶中进行Western blot实验，用电泳分离不同相对分子质量的蛋白质后电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，室温，孵育于5%脱脂牛奶1 h；4℃条件下孵育1∶1 000稀释的α-SMA、SM-MHC、calpoin一抗、1∶2 000稀释的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK一抗、1∶5 000稀释的β-actin一抗过夜；次日室温孵育1∶2 000稀释的二抗1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到相应的蛋白质条带。以β-actin条带的灰度值为内参，计算α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平；以信号蛋白质相应总蛋白质的灰度值为内参，计算磷酸化信号蛋白质的表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。实验数据均为计量资料，采用均数±标准差表示，经正态性检验符合正态分布，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞的鉴定

BMSC表面干细胞标志基因CD44、CD90的阳性率均在99%以上，而造血细胞表型标志基因CD45的阳性率仅0.1%，符合干细胞特性。见图1。

2.2 电刺激对骨髓间充质干细胞增殖活力的影响

干预后第2天、第4天、第6天、第8天、第10天时，对照组与电刺激组BMSC的OD450水平比较，差异无统计学意义 （t=0.171、0.2841、0.112、0.093，P＞0.05）。见图2。

2.3 电刺激对骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响

干预后第10天时，电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 对照组与电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin表达水平的比较Tab.1 Comparison of BMSC expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin between control group and electrical stimulation group

2.4 电刺激对骨髓间充质干细胞中PI3K/Akt通路及ERK的影响

干预后第10天时，电刺激组BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表达水平均高于对照组，差异有显著统计学意义（P<0.01）。见表2。

表2 对照组与电刺激组BMSC中p-PI3K、p-Akt、p-ERK表达水平的比较Tab.2 Comparison of BMSC expression level of p-PI3K,p-Akt and p-ERK between control group and electrical stimulation group

2.5 PI3K抑制剂及ERK抑制剂对电刺激促进骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响

溶剂+电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平均高于溶剂对照组（P<0.05）；LY+电刺激组、PD+电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平均低于溶剂+电刺激组（P<0.05）。见表3。

表3 溶剂对照组、溶剂+电刺激组、LY+电刺激组、PD+电刺激组α-SMA、SM-MHC、calpoin表达水平的比较Tab.3 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in solvent group,solvent+electrical stimulation group,LY+electrical stimulation group and PD+electrical stimulation group

2.6 敲低PI3K、ERK对电刺激促进骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响

si-NC+电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平均高于si-NC组（P<0.05）；si-PI3K+电刺激组、si-ERK+电刺激组BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平均低于si-NC+电刺激组（P<0.05）。见表4。

表4 si-NC组、si-NC+电刺激组、si-PI3K+电刺激组、si-ERK+电刺激组α-SMA、SM-MHC、calpoin表达水平的比较Tab.4 Comparison of expression level ofα-SMA,SM-MHC and calpoin in si-NC group,si-NC+electrical stimulation group,si-PI3K+electrical stimulation group and si-ERK+electrical stimulation group

3 讨论

近些年，组织工程技术在组织修复中的作用受到越来越多关注，BMSC是组织工程中常用的种子细胞，用于心肌梗死[6，7]、脊髓损伤[8，9]、脑梗死[10，11]、脑外伤[12]等能够促进组织修复、改善脏器功能。盆底功能障碍性疾病以盆底组织结构损伤为特征，包括压力性尿失禁和盆腔器官脱垂，严重影响患者的生存质量。盆底支持组织中的SMC对维持盆底功能具有重要意义，进行干细胞移植并促进干细胞向SMC分化是近些年组织工程技术治疗盆底功能障碍性疾病主要思路[13，14]。

干细胞具有多向分化潜能，施加一定的干预条件以促进干细胞向SMC分化在盆底功能障碍性疾病的治疗中具有重要意义。电刺激是临床上治疗盆底功能障碍性疾病的常用手段，主要通过增强盆底肌肉功能起到治疗作用[15，16]。干细胞的相关研究证实，电刺激是诱导干细胞分化的重要物理手段，在神经元干细胞向神经元细胞分化的过程中，电刺激起到促进作用[4]。笔者将电刺激用于BMSC的干预，旨在发挥电刺激调控干细胞分化的作用。在电刺激干预后通过检测SMC标志蛋白α-SMA、SM-MHC、calpoin表达的方式评价SMC分化程度，结果显示电刺激后BMSC中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平显著增加，表明电刺激对BMSC向SMC的分化具有促进作用。

BMSC向SMC分化的调控机制涉及复杂的生物信号转导网络，其中PI3K/Akt通路、ERK通路是已知参与BMSC向SMC分化调控的信号通路。根据Wei S等[5]研究，激活PI3K/Akt通路和ERK通路对SMC的分化具有促进作用。另有电刺激相关的研究证实，电刺激对上皮细胞、内皮细胞中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促进作用[17～19]。笔者研究在使用电刺激对BMSC进行干预后观察到细胞中p-PI3K、p-Akt、p-ERK的表达水平显著增加，表明电刺激对BMSC中PI3K/Akt通路、ERK通路的激活具有促进作用，调控上述信号通路可能是电刺激促进BMSC向SMC分化的分子机制。

为了进一步明确PI3K/Akt通路、ERK通路在电刺激促进BMSC向SMC分化中的作用，笔者分别通过使用信号通路抑制剂及转染siRNA的方式进行验证。LY294002和PD98059分别是目前使用最广泛的PI3K抑制剂和ERK抑制剂，对两种信号蛋白的磷酸化具有抑制作用，进而抑制信号通路的激活。在电刺激干预的同时加用信号通路抑制剂，细胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平显著降低。转染siRNA是特异性敲低基因表达的有效手段，在电刺激干预的同时转染PI3K或ERK的siRNA，敲低PI3K或ERK的表达后，细胞中α-SMA、SM-MHC、calpoin的表达水平显著降低。以上结果表明信号通路抑制剂及敲低信号蛋白表达均能削弱电刺激对BMSC向SMC分化的促进作用，进而表明电刺激促进BMSC向SMC分化的作用与激活PI3K/Akt通路、ERK通路有关。