脉络膜新生血管动物模型的研究进展

陈水龄，李欣，褚文丽，陶方方，周雅琪，李维义，亢泽峰

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是多种眼底疾病的最终病理表现，如年龄相关性黄斑病变（age-related macular degeneration，AMD）、病理性近视（pathological myopia，PM）、中心性渗出性脉络膜视网膜病变（central exudative choroidal retinopathy，CEC）及组织胞浆菌病等。CNV 的发病机制目前尚不明确，通常认为与衰老、遗传、环境、视网膜慢性光损伤、营养、代谢障碍及炎症等有关。建立成模率高、重复性好、成本低的CNV 实验动物模型对于深入研究CNV 的发病机制、病理改变及临床治疗等具有重要意义。本文拟从CNV 实验动物的选择、CNV 动物模型的建立方法及评价方法等方面进行总结和梳理，为CNV 的基础实验研究提供参考。

1 实验动物的选择

用于CNV 模型的实验动物主要有鼠、猴、兔、猪、羊和猫等，其中较为常见的有挪威棕色（brown norway，BN）大鼠、C57BL小鼠、恒河猴及兔。

BN 大鼠的脉络膜组织与人脉络膜结构相似[1]，含有大量的色素细胞，可吸收大量光能量。C57BL小鼠脉络膜组织与人的脉络膜结构相似[2-3]，有单层立方色素上皮细胞[4]。BN大鼠和C57BL 小鼠取材方便，存活率高，成熟周期短，成本较低，因此，成为CNV 造模的主要动物来源。但鼠类眼球较小，对于激光操作难度增加；此外，鼠与人还存在黄斑解剖学上的差异。

猴CNV模型与人类CNV的改变非常类似[5]，此模型得到了一致的认可，但动物来源受限，费用较高，CNV诱发时间较长，限制了其广泛应用。兔CNV 模型可见少量报道[6-7]，因兔CNV 模型在眼底荧光血管造影（fundus fluorescein angiograph,FFA）中不具有荧光素渗漏的特征，且兔眼底血管循环结构与人类差异较大，目前很少应用。羊CNV 模型报道较少[8]，但羊习性温顺，实验眼便于观察，且羊眼实验不影响肉用羊的经济效果，作为大型动物模型制备容易，费用低，操作难度小，有望成为CNV模型的常用大型动物。

2 CNV动物模型的建模方法

目前，建立动物CNV 模型的方法主要有：激光诱导[9]、视网膜下注射生长因子诱导[10-11]、视网膜下注射基质胶[12]、手术及基因工程诱导[13]等，其中激光诱导的CNV模型应用最为广泛。

2.1 激光诱导

激光诱导CNV 模型的主要机制为选择性破坏光感受器外节、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞、Bruch 膜和脉络膜毛细血管。其中Bruch 膜的破坏在CNV 的生成中至关重要，损伤后引发损伤修复反应，包括损伤区早期细胞浸润，继而形成新生血管等。

2.1.1 激光种类及参数的选择 用于CNV 模型制作的激光器包括半导体激光、氩激光、氪激光、染科激光及倍频激光等。激光参数主要有激光波长、光斑直径、输出功率及曝光时间等方面，实验操作中以光凝处产生气泡伴轻微爆破声作为击穿Bruch 膜的标志，若出血或无气泡出现则视为无效。因此，激光各参数的选择对于成功诱导CNV 模型尤为关键，常见的参数特征如表所示（表1）。

表1 常见的激光诱导CNV动物模型的参数特征

2.1.2 激光诱导的动物CNV 与人类CNV 的异同（1）激光诱导的动物CNV 与人类CNV 有许多共同之处，如CNV 中血管内皮细胞主要源于脉络膜毛细血管，病理基础相同，即Bruch 膜-RPE-脉络膜毛细血管复合体损伤，导致促血管生成因子与血管生成抑制因子间平衡的破坏，使内皮细胞发生增生、移行和管腔形成等一系列新生血管形成。（2）激光诱导的CNV 模型与人类CNV 的发病机制存在差异，前者采用激光击穿Bruch 膜及RPE 层的方法，诱导脉络膜毛细血管生长于RPE 层下或神经纤维层下，伴有视网膜损伤，属于机械性破坏；后者为各种原因导致的RPE-Bruch 膜-脉络膜毛细血管复合体损伤，使Bruch 膜内胶原层增厚以及弹力纤维层断裂，进而导致脉络膜毛细血管长入RPE 层下或感觉神经纤维层下，与蛋白水解酶表达水平的改变如基质金属蛋白酶抑制因子的低表达或基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的过度表达，以及巨噬细胞等炎症细胞有关。

2.1.3 激光诱导CNV的优点

激光诱导的CNV 动物模型发生率较高，大约为60%～70%，在光凝后短期时间（7 d）内即可产生，而且激光斑的荧光素渗漏在10～14 d 达到高峰，便于进行干预性研究；诱导CNV 的条件也可标准化，价格相对便宜，是目前眼科诱导CNV最常用的动物模型。

2.2 生长因子诱导

生长因子诱导的CNV动物模型[47]，如视网膜下注射载有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的腺相关病毒载体、重组VEGF 明胶微粒诱导CNV 模型、视网膜下注射碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）凝胶微粒诱导兔CNV 模型、视网膜下注射bFGF/脂多糖诱导兔CNV 模型、脉络膜上腔植入bFGF 微渗透泵诱导猪CNV模型等。

2.3 基质胶诱导

基质胶是一种注入体内后能转化为固体并缓慢释放血管生成因子的蛋白混合物。基质胶单独注射或联合VEGF注射，可以产生100%的CNV 病变，并能成功模拟出人类渗出性AMD 中参与新生血管反应的相似细胞组分。正常SD大鼠视网膜下注射基质胶后，可观察到RPE 层的易位和CNV的形成[48]。

2.4 转基因或基因敲除诱导

转基因和基因敲除建立CNV 模型是一种新兴技术，针对CNV 发展的关键因素建立基因工程模型，可从不同角度分析各分子对CNV 形成的影响，包括：（1）VEGF164RPE65转基因小鼠[49]；（2）双倍体（Tet/VMD2/VEGF）和三倍体（Tet/VMD2/VEGF/An2）转基因小鼠，视网膜可高表达VEGF，若同时视网膜下注射血管生成素2（angiogenin 2，Ang 2），能够100%形成CNV[50]；（3）趋化因子CC 类受体2（chemokine CC motif receptor 2，CCR2）/趋化因子CC 类配体2（chemokine CC motif ligand 2，CCL2）基因缺失诱导小鼠CNV 模型[51]，其成模率大约25%；（4）载脂蛋白E 基因（apolipoprotein E，ApoE）过表达小鼠CNV 模型是研究AMD 病变中自发性CNV形成机制的重要模型[52]；（5）CCL2 和CX3C 趋化因子受体1（CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1）基因缺陷小鼠；（6）超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）基因缺陷老化小鼠[53]；（7）极低密度脂蛋白受体（very low density lipoprotein receptor，VLDLR）定向突变小鼠；（8）视紫红质基因启动子/VEGF过表达小鼠。

转基因或基因敲除诱导的CNV 模型具有诱导快，发生时间短等优点，与CNV 病理生理学关联性强，对CNV 发生机制的研究具有针对性，同时研究者可根据不同需求选择模型并修改参数；缺点有CNV诱导率低、面积小、价格贵等问题。

2.5 手术诱导

采用手术清除RPE 层后再机械性破坏Bruch 膜可造成CNV，与人类CNV 类似。如应用硅胶镶管剥离视网膜色素上皮建立CNV 模型，后来研究发现不剥离视网膜色素上皮而直接穿通Bruch 膜诱导的CNV 模型，具有更厚的薄膜、更多的新生血管，并且FFA 渗漏增加，重复性更高[54]。虽然手术诱导的CNV 模型具有神经视网膜损害少的优点，但成本高，同时受手术操作的熟练程度的限制。

2.6 其他方法

应用强化循环光诱导CNV 大鼠模型[55]，将12 周龄SD 大鼠和Wistar大鼠每日暴露于36瓦荧光灯泡发出3,000 Lux的冷白光12 h（正常组循环光强为70 Lux），持续6个月，在强化光照1 个月即可出现CNV，在6 个月时CNV 和视网膜血管交联，形成新生血管网。此外，还有利用Xenon 灯光凝家猪视网膜诱导CNV 形成、丙烯醛灌胃诱导大鼠CNV 形成[56]等造模方法。

3 CNV动物模型的评价方法

观察和评价CNV 的方法主要有活体影像学检查和组织样本病理学检查。活体的影像学检查有FFA、吲哚菁绿血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）及光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）观察等；组织样本的病理学检查主要有苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、免疫组织化学染色及脉络膜铺片等。

3.1 FFA和ICGA

FFA 和ICGA 可动态观察CNV 的形成过程，是较为快速和简便的观察方法。新生血管在FFA 造影早期出现荧光，FFA 晚期光凝区圆盘状荧光素渗漏，根据荧光素渗漏程度可判断CNV 形成的程度[57]。但应注意的是FFA 上的荧光素渗漏与真正的血管渗漏之间的关系还不清楚，只能作为间接反映CNV 渗漏的指标，FFA 荧光素渗漏不一定都有CNV 形成。吲哚菁绿是大分子物质，可渗透进入脉络膜血管，但不能穿透RPE层视网膜血管渗漏，因此，ICGA呈现充盈状态的光凝斑一定有CNV 形成，ICGA 能更清晰地显示CNV 的轮廓，但荧光效应弱，为荧光素钠的1/25，显示的图像不如FFA 清晰。FFA 与ICGA 联合应用，可提高CNV 检测的准确性，排除非CNV原因所导致的高荧光结果。

3.2 OCT

OCT利用光干涉原理可清晰地观察视网膜各层结构，准确地显示眼底病变的深浅位置及黄斑区厚度，对视网膜及脉络膜新生血管的诊断具有重要价值，且为无创性检查。但是由于CNV 实验目前大多采用鼠作为实验动物，鼠眼较小，缺乏配套的机器，故还未普遍用于实验动物CNV的观察。

3.3 HE染色

组织切片HE 染色后，可利用光镜及电镜大体观察实验性CNV 的形态、组织结构变化、CNV 周围的细胞构成，操作简单，结果直观，实验广泛采用。

3.4 免疫组织化学染色

免疫组织化学染色采用标记的特异性抗体对组织内抗原的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原，并进行定位、定性和定量分析；免疫组织化学检查可半定量观察CNV 组织的蛋白质表达情况，结果更具有客观性。如采用免疫组织化学染色标记CNV 组织中内皮糖蛋白表达作为CNV生成的标志[58]。

3.5 脉络膜血管铺片

脉络膜血管铺片利用了荧光素标记的大分子右旋糖酐，它具有标记血管容积的特性，从而标记CNV。此方法可较好保持CNV 的固有形态，CNV 呈现的强荧光区与周围组织对比强烈，易于观察，且通过计算机图像分析系统测量强荧光区域，能够客观地对CNV进行半定量分析[59]。

4 小结

目前实验性CNV 动物模型的理论基础主要建立于击破Bruch 膜或产生过量的VEGF，建模方法各有优缺点。在众多建立CNV 模型的方法中，激光诱导CNV 模型条件较成熟，研究历史久，可靠性高，应用广泛。由于动物体内环境不同于人体内环境，各种方法诱导的CNV 动物模型也仅能模拟人类CNV，不能完全代替人类CNV 发展的自然过程，因此，研究结果仅能为CNV发病和机制研究提供实验理论依据。