饲养林麝毛发皮质醇含量及其指示作用

李大卫，胡德夫，张天祥，郭小兵，石明慧，靳玮江，张宝峰，刘树强

(北京林业大学生态与自然保护学院，北京 100083)

野生动物处于人工设施条件下会遭受多种因子的刺激并引发生理应激[1-2]，常见的应激因子有管理活动[2]、饲养空间[3]、运输[4]、社群结构[5]等。研究表明，短期生理应激可提升动物机体的适应能力，而长时间的生理应激则会造成损害，即恶性应激[6-7]。迄今为止，研究者主要通过采集动物的血液、唾液、尿液、粪便、毛发样品并测定皮质醇(或皮质酮)含量，探查动物的生理应激状态[8]，除血液外，其他均为非损伤取样途径。非损伤取样方法具有明显的优势，可在不干扰动物生活状态下获取研究样品，因而得到了广泛的运用[9]。各种非损伤样品的获取难度各不相同，同时，探查的生理应激时段存在较大差异，一般而言，唾液、尿液、粪便可探查数小时至数天内动物生理应激的平均状态，而毛发皮质醇则反映其生长期的生理应激状态[10]。毛发皮质醇浓度主要为两部分循环皮质醇浓度的积累量，其一为动物维系生理过程的基本稳态的基线浓度[11]，其二为动物急性应激反应过程所产生的激发浓度[7]。较高的浓度代表一段时间内动物暴露于压力源而持续分泌的皮质醇，相反，较低的浓度代表其基线或暴露于压力源下的皮质醇浓度低于其发挥生理调节作用所必需的浓度[12]。动物毛发皮质醇浓度受到多种因素的影响，如年龄[13]、性别[14]、栖居环境[15]等。显然，动物毛发适于探查长期存在的应激源及其对动物的影响。

麝类具有胆怯、独居、领域性的生物学特性[16]，同时，研究表明，饲养林麝个体在生理应激上具有差异性[17-18]。饲养条件下，林麝群居和有限空间均偏离其独居和领域性的生物学特性，会导致林麝出现慢性生理应激[19]，但饲养林麝的麝场规模对生理应激的影响及不同敏感程度的林麝在不同饲养环境中的应激表达尚不清楚。为此，本研究遴选了陕西秦岭地区不同规模的麝场，采用毛发皮质醇测定方法，探查饲养条件下林麝的生理应激状态及其差异性，分析麝场规模和饲养空间是否影响林麝生理应激的表达，旨在为林麝饲养基地的建设和管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究地点位于陕西省宝鸡地区，地理位置106°18′～108°03′E，33°35′～35°06′N，属于秦岭山地的西段，平均海拔2 000 m，年均气温13 ℃，平均降水量700 mm。该区域是我国林麝人工饲养繁育的主要地区，目前拥有全国60%以上的饲养林麝种群。

本研究采样时间为2019年2月下旬至3月，采样地点包括凤县、留坝县、眉县、陇县，共计25家麝场。林麝圈舍规制类似，圈舍之间以围墙隔开，每个圈舍拥有3～5个可供每只麝独立栖居的封闭式小舍(约4 m2)和1个共用露天活动场(15～100 m2)，但不同麝场在饲养管理方式上存在一定差别。为避免不同孕期阶段对雌性林麝毛发皮质醇含量的影响，所有采样个体均为雄性，按麝场规模、饲养空间采集不同麝场的林麝毛发。采样期处于雄麝繁殖期(10月下旬—次年2月上旬)与泌香期(5月上旬—7月中旬)之间的时间段，属于生理稳定期。

1.2 研究方法

采样过程中2人迅速捕捉并保护固定林麝，1人快速剪取采样个体左腿靠近背部的毛发，剪取面积约2 cm2，长度约6 cm，约1 g，即采样个体的毛发类型和部位保持一致。共计采集雄性林麝个体142只。参照以往研究者的方法[20-22]，所采集毛发在实验室使用异丙醇洗涤，去除表面污染，然后置于玻璃培养皿内烘干，将毛发置于研钵，加入液氮并研磨粉碎，每份毛发样品称取0.2 g，加入8 mL无水乙醇，室温下静置24 h，采用转速2 000 r/min离心机处理15 min，吸取每个样品的上清液2 mL放入试管中，使用烘干机进行干燥，然后重新溶于1 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.2)。采用酶联免疫方法(ELISA)测定毛发皮质醇含量，皮质醇试剂盒购自北京北方生物技术研究所，灵敏度为1.5 ng/mL，批内变异度为5%，批间变异度为9%。

1.3 数据分析

使用SPSS 19.0进行数据分析及作图，显著性水平设定为α=0.05。所有数据在统计学分析之前进行K-S检验、方差齐性检验。数据结果以平均数±标准偏差表示。采用单因素方差分析各年龄组的差异，采用LSD检验进行两两比较；采用系统聚类法对林麝毛发皮质醇进行分组，采用K-Means聚类的方法对麝场规模和饲养空间进行聚类，采用卡方检验毛发皮质醇含量在不同规模麝场和饲养空间的差异性。

2 结果与分析

2.1 林麝毛发皮质醇含量与年龄的关系

林麝毛发皮质醇含量的测定结果显示(表1)，所有年龄组林麝毛发皮质醇含量平均值为479.39 ng/g，最高为6岁年龄组[(508.27±262.32) ng/g]，最低为8岁年龄组[(447.74±157.11) ng/g]。单因素方差统计分析结果表明，各年龄组成年雄麝毛发皮质醇含量没有显著差异(P>0.05)，因此，可将各年龄组的林麝样本合并为一个数据集合。

2.2 林麝毛发皮质醇含量的分组

采用系统聚类法分析142只雄性林麝毛发皮质醇含量，可将所有林麝分为两组(表2)，即高皮质醇组(Ⅰ组)和低皮质醇组(Ⅱ组)。非参数独立样本K-S检验结果显示，Ⅰ组与Ⅱ组毛发皮质醇含量具有显著差异(χ2=32.727,P<0.01)。Ⅰ组和Ⅱ组分别占所采用个体总数的8.45%、91.55%。

表2 林麝毛发皮质醇含量的分组比较Table 2 Comparison of cortisol contents in hair of Moschus berezovskii

2.3 麝场规模与毛发皮质醇分组的比较

采用K-Means聚类，可将采样的麝场按规模分为3类，即小规模(平均38只)、中规模(平均124只)、大规模(320只)。其中，小规模麝场21个，中规模麝场3个，大规模麝场1个。分析表明(表3)，Ⅰ组在小规模麝场占比最高，为10.2%，Ⅱ组在中规模麝场占比最高，为96.3%;卡方检验结果表明，林麝毛发皮质醇的各组在不同规模的麝场的分布不存在显著差异(χ2=1.321，P=0.517)。

表3 毛发皮质醇分组在不同规模麝场所占的比例Table 3 The proportions of hair cortisol grouping in different Moschus berezovskii farm scales

2.4 麝场饲养空间与毛发皮质醇分组的比较

采用组K-Means聚类，可将麝场每只麝占有共同活动的面积分为3类，即小圈(平均18 m2)、中圈(平均30 m2)、大圈(平均44 m2)，其中小圈舍的麝场12个，中等圈舍的麝场7个，大圈舍的麝场6个。分析发现(表4)，I组在小圈占比最高，为18.4%，Ⅱ组在大圈占比最高，为97.9%;卡方检验表明，林麝毛发皮质醇的各组在不同圈舍的分布存在显著差异(χ2=9.658，P=0.008)。

表4 麝场圈舍面积与毛发皮质醇分组的比较Table 4 Comparison of the area of Moschus berezovskii farms and hair cortisol grouping

3 讨 论

动物皮质醇广泛参与个体生理活动的各个方面，因而在一定程度上反映了动物生理状态[23]。研究表明，动物的年龄与皮质醇水平存在一定联系，狒狒(Papioanubis)毛发皮质醇含量从婴幼期到成年期逐渐降低，之后随年龄增长会再次升高[24]；而成年德国牧羊犬的各年龄组毛发皮质醇含量则没有明显差异[25]。可见，动物在成年期的毛发皮质醇变化存在物种间的差异。本研究得出，成年雄性林麝在3～9岁龄的毛发皮质醇随年龄的变化差异不显著，说明成年雄麝在人工饲养条件下表现出相对稳定的生理状态。

麝科物种均具有领域性、独居且胆怯的生物学特性[16]，而人工条件下均采用群体饲养繁育的方式，即多只林麝置于有限的空间范围，显然这种方式违背了林麝的生物学特性。何岚[17]研究了饲养空间对林麝皮质醇水平的影响，得出随着饲养空间的改善，雌麝皮质醇水平会升高，而雄麝则无变化，认为在一定程度上饲养环境抑制了林麝的生理活动且雄麝更为严重，即饲养林麝处于慢性应激状态。Yang等[26]的研究表明，饲养雄性林麝对外界因子刺激存在明显的个性差异。本研究通过雄麝毛发皮质醇含量测定得出，雄麝毛发皮质醇含量分为高含量组(I组)和低含量组(Ⅱ组)。依上述分析，笔者认为，Ⅰ组雄麝为对饲养环境各种刺激处于相对不敏感的个体，因而保持了相对较高的皮质醇水平，而Ⅱ组雄麝则为较为敏感的个体，生理活动受到抑制而呈现皮质醇相对较低的水平。林麝毛发皮质醇含量反映其生长期的皮质醇平均水平，即较长时间的生理应激状态。研究表明，慢性应激可以导致动物皮质激素的分泌量反而低于正常值[27-29]。因此，笔者认为，Ⅱ组雄麝可能处于较为明显的慢性应激生理状态，其占整个采样个体的91.55%，而I组仅占8.45%。这个比例与王毅花[18]通过大样本(超过100只)和较长时间(超过10 d)对饲养林麝的采样和分析结果基本相同，说明饲养林麝普遍处于慢性生理应激状态。这个结果也从一个侧面说明了饲养林麝存在的疾病高发及死亡率高的问题。

本研究进一步分析得出，高皮质醇组(即低敏感)和低皮质醇(即高敏感)在不同规模麝场的分布没有显著差异，即同一麝场的雄麝数量和气味交流并未影响到两组雄麝的比例构成，其原因可能是即使小规模麝场的较少雄麝数量也已超出了雄麝彼此可忍受的范围，或麝场所在的山区通风条件较好，气味得以快速散去，未影响到雄麝的生理应激状态，就此问题仍需要更深入的研究。然而，两组毛发皮质醇比例与麝场的饲养空间(即单只林麝拥有的面积)之间存在显著相关性，高皮质醇组(即低敏感)在较小饲养空间占有较大比例，而低皮质醇(即高敏感)在较大饲养空间占有较大比例，这与何岚[17]的实验结果相反。分析各麝场的饲养方式发现，较小饲养空间的麝场均为农户持有的小规模麝场，活动面积相对较小，所有林麝同时拥有有限的共同活动场所，因而林麝不能充分发挥奔跑和弹跳的行为习性，而较大饲养空间的麝场为药企或公司持有的大规模麝场，因活动面积相对较大，雄麝奔跑和弹跳易于伤害雌麝，一般采用轮流出来活动，平时关禁于狭小的各单独小舍内，这样反而限制了其活动自由。因此，表面上较大的饲养空间实际上却导致了较高比例的低皮质醇组(即高敏感)。本研究表明，林麝毛发皮质醇含量能反映其生理应激状态，可用于监测饲养林麝在生长期数月内的一般生理应激状况，较之尿液和粪便具有明显的优势。同时，林麝毛发皮质醇含量及其分组可以指示各麝场的饲养模式和管护方式对林麝生理应激的影响，可为调整饲养和管护方式提供科学依据，并提升饲养林麝的健康水平，有助于林麝饲养繁育业的发展。