不同叶色青钱柳叶片色素、多酚含量及光合特性的差异

徐展宏，朱 莹，金慧颖，孙操稳，方升佐

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

植物的新叶泛红现象也被称为“延迟变绿”，被认为是植物在叶片最脆弱的展叶阶段选择的一种生态适应策略，以此来应对害虫、病菌、强光、低温等外界胁迫因素的侵袭[1-2]。植物“延迟变绿”是通过延缓叶片展叶阶段的叶绿体发育，并合成高浓度的花色素苷实现的，然而这种适应策略降低了光能的利用效率[3]。早期研究认为，黄酮类物质(包括花色素苷)会拦截过剩的光能从而起到光保护的作用[4]，高浓度花色素苷使叶片在强光或高温胁迫下表现出更高的抗性，也有研究认为新叶积累花色素苷是抵御害虫和真菌[5-6]，红色新叶可能会同时积累其他抗性相关次生代谢物，如单宁类和黄酮类化合物[7-10]，这些多酚物质除了可提高抗逆性，还可通过共色效应提高花色素苷的稳定性和显色效果[11]。

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)是我国特有的多功能树种[12-15]。已有研究证明，青钱柳次生代谢物含量在种源、家系内部不同载培条件下存在较大变异[16-18]，因此，应从单株水平开展青钱柳特异性种质资源的评价筛选，以求精准筛选优良个体，并进行无性繁殖。田力等[19]研究发现收集的青钱柳种质资源中存在少量红叶个体，其嫩梢新叶呈现显眼的红色，相对绿色新叶个体有更丰富的景观效果，具有更高观赏价值，且红叶个体的青钱柳在总黄酮、总三萜和多糖等生物活性物质与绿叶青钱柳个体存在差异。然而，红叶青钱柳的叶色转变与光合特性、次生代谢物的累积规律间的关系尚不明确。因此，本研究通过测定不同表型和不同季节青钱柳叶花色素苷、类胡萝卜素和叶绿素3类主要呈色色素，以及黄酮、单宁两类抗性物质含量及净光合速率(Pn)和PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)，比较红叶青钱柳与绿叶青钱柳的差异，分析两者叶主要色素、多酚类物质含量和光合特性间的关系，以期为青钱柳高生长、高抗性、高质量优良单株筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与供试材料

试验地设在江苏南京市溧水区南京林业大学白马教学科研基地(119°09′E，31°35′N)，处于由北亚热带向中亚热带的过渡区。该区四季分明、气候温和湿润、雨量充沛、光照充足、无霜期长、水热同季，年平均气温15.4 ℃，全年无霜期237 d，年平均日照2 240 h，年平均降雨量1 087.4 mm。

试验材料取自白马基地青钱柳种质资源圃4年生同龄林，造林株行距为2 m×3 m。在青钱柳种质资源圃内选取3个具红、绿2种叶色类型的家系单株(分别为浙江千岛湖家系2号、湖北五峰家系1号和2号)。每个家系分别选取2株红色新叶个体代表青钱柳红叶类群(简称RWW，red wheel wingnut)和2株绿色新叶个体代表青钱柳绿叶类群(简称GWW，green wheel wingnut)进行取样，即从12个单株取样，红叶和绿叶青钱柳各6株。力求个体间长势相近、无病虫害，每个单株标记不同方向的3枝一级侧枝供后续采样。

1.2 研究方法

1.2.1 采样方法

分别于2020年6月7日、6月18日、6月30日、7月25日和8月30日采集标记侧枝当年生枝条的新叶和成熟叶。将枝条从上到下第2、3侧枝上完全展开的叶作为新叶(红叶个体新叶记作RF，red fresh，绿色新叶记作GF，green fresh)，将第6、7叶当作成熟叶(红叶个体成熟叶记作RM，red mature，绿叶个体成熟叶记作GM，green mature)，每根一级侧枝采5片成熟叶、5片新叶。剪下小叶，混匀后放入自封袋于4 ℃保存，用于花色素苷、叶绿素、类胡萝卜素、单宁和黄酮含量的测定。

1.2.2 花色素苷、叶绿素和类胡萝卜素含量测定

将取回的样品，用纸巾擦净表面污物，除去中脉，然后剪成2 mm左右的细丝并混匀，用于测定花色素苷、叶绿素和类胡萝卜素含量。

花色素苷的提取和含量测定参照唐前瑞等[20]的方法，略有修改。用电子天平准确称取0.5 g 剪好混匀的叶片细丝，置于10 mL离心管中；加入5 mL 0.1 mol/L盐酸提取液，32 ℃恒温箱中提取4 h，1 000 r/min、4 ℃，离心20 min;准确吸取200 μL上清液到96孔不可拆酶标板，用SynergyLX多功能微孔板检测仪(SynergyLX multi-mode reader，美国伯腾仪器有限公司)于530 nm测定吸光度值，重复3次。以提取液做对照。以每克鲜质量在10 mL提取液中0.1 吸光度(OD)为1个色素单位(pigment unit，记为U),计算花色素苷相对含量。

叶绿素和类胡萝卜素提取参照刘洋[21]的方法，然后按照Porra等[22]的方法计算叶片中总叶绿素(Chlt)和类胡萝卜素(Car)的含量(mg/g)。

1.2.3 单宁和黄酮含量测定

将小叶放入鼓风烘干箱中以65 ℃烘干至质量恒定，粉碎后过孔径0.42 mm筛，混匀过筛后的粉末用于单宁和黄酮含量的测定。单宁含量的测定参照袁红娥等[23]和徐伟[24]的方法；黄酮的提取和测定参照岳喜良等[25]的方法。

1.2.4 净光合速率(Pn)与PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)测定

于8月30日晴朗无风的上午(9:00—10:00)，用CIRAS-II型便携光合作用仪(CIRAS-3II Portable Photosynthesis System，美国PP SYSTEMS公司)在每株树的3根标记枝条各选取1片新叶和1片成熟叶测定光合参数，使用开放式气路和人工LED光源[光强1 000 μmol/(m2·s)，气流速度500 μmol/s，CO2含量为400 μmol/mol]测定净光合速率(Pn)。

分别于2020年7月25日和8月30日天气晴朗的下午(13:00—14:00)在每株树的3根标记枝条各选取1片新叶和1片成熟叶，用暗适应夹夹取每片复叶上中下3个部位的小叶，暗处理30 min，用FMS2便携调制式荧光仪(FMS2 Pulse Modulated Fluorometer，英国Hansatech公司生产)对同一叶片的叶绿素a荧光特性进行估算。在连续测量光强[1 200 μmol /(m2·s)]下测得最小荧光(F0)，然后在5 000 μmol/(m2·s)的脉冲光化光下测得最大荧光(Fm)。按Fv/Fm= (Fm-F0)/Fm计算PSⅡ最大量子产率(最大光化学效率)。

1.3 数据处理

采用单因素方差分析方法比较不同叶色青钱柳不同类型叶及不同时期的色素含量、次生代谢物含量差异，并用 Duncan’s 新复极差法分析不同类型叶间和同一类型叶不同期间各项指标的差异显著性；用Pearson相关模型分析各指标间的关系。数据统计分析均采用SPSS 22.0。

2 结果与分析

2.1 不同叶色青钱柳叶色素含量的动态变化

方差分析表明，RF花色素苷含量在各采样时期均显著高于其他3种类型叶(P<0.05，图1a)，变异范围为1.99～4.56 U。RM、GF和GM的花色素苷含量之间无显著差异(P>0.05)，3种叶中花色素苷含量平均值相较RF分别低79%、75%和79%。同一类型叶花色素苷含量在不同月份有显著变异(图1a)，从6月初到8月末大致呈现出下降趋势。如RF叶花色素苷含量最高值(4.56 U)出现在6月18日，比8月30日测定值(1.99 U)高出约1.79倍，与叶的颜色特征一致。即在6月RF叶片呈现明显的红色，之后叶色逐渐变绿；而其他3种叶型花色素苷含量在各自不同采样时期虽存在显著差异，但三者花色素苷含量在取样期间始终较低，叶色一直为绿色。

红色新叶青钱柳和绿色新叶青钱柳两个类群的成熟叶(RM和GM)叶绿素含量均显著高于其新叶(RF和GF)，但RM和GM两种成熟叶叶绿素含量无显著差异(P>0.05，图1b)。RF叶绿素含量始终低于GF，各月平均值约低26%。4种类型叶的叶绿素含量基本上呈现抛物线型的季节变化模式。如RF叶中叶绿素含量在6月18日达到峰值(7.96 mg/g)，而6月8日和8月30日含量最低，比6月18日分别低33%和36%。4种类型叶类胡萝卜素含量的差异、变化趋势与其叶绿素含量的变化趋势相似(图1b和图1c)。

综上所述，青钱柳叶色的变化主要取决于不同发育阶段叶各种色素含量的高低。发育初期红色新叶(RF)花色素苷含量显著高于成熟叶(RM)，而叶绿素含量显著低于RM，叶色为红色；但随时间推移，花色素苷含量逐渐下降。

不同大写字母为同一取样时间不同类型叶在0.05水平上差异显著;不同小写字母为同一类型叶不同取样时间在 0.05 水平上差异显著。下同。Different capital letters indicate significant differences among the difference kinds of leaf types at the same sampling time at the 0.05 level.Different lower case letters indicate significant differences among different sampling time in the same leaf type at the 0.05 levels.The same below．图1 红叶青钱柳和绿叶青钱柳叶花色素苷、叶绿素和类胡萝卜素含量的差异(n=60)Fig.1 Differences in anthocyanin,chlorophyll,and carotenoid contents between red-leaf and green-leaf Cyclocarya paliurus(n=60)

2.2 不同叶色青钱柳叶单宁和黄酮含量的动态变化与差异

RF、RM、GF和GM 4种类型叶的单宁含量在6月8日—8月30日均呈现上升趋势，RF、RM和GM均在7月25日达到峰值,分别为15.18、11.97和10.52 mg/g,GF单宁含量于8月30日达到峰值10.63 mg/g。RF单宁含量在多数采样期(6月8日、6月30日、7月25日和8月30日)均显著高于其他3种类型叶(P<0.05,图2a)，RM在6月18日、7月28日和8月30日均显著高于GM(P<0.05),其他采样期无显著差异(P>0.05)。

RF的黄酮含量在各采样时期均高于其他3种类型叶(图2b)，但只在6月8日存在显著差异(P<0.05)，就新叶而言，RF黄酮含量在各时期均高于GF，但只有在6月8日两者存在显著差异(P<0.05)，就成熟叶而言，RM黄酮含量在6月8日和6月18日显著高于GM，但在6月30日、7月25日和8月30日两者均无显著差异。

图2 红叶青钱柳和绿叶青钱柳在不同时间叶单宁和黄酮含量的差异(n=60)Fig.2 Differences in leaf tannin and flavonoid contents between red-leaf and green-leaf C．paliurus(n=60)

2.3 不同叶色青钱柳PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和净光合速率(Pn)的差异

不同青钱柳叶型PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)的差异如图3a。4种类型叶Fv/Fm存在显著差异，其中RF叶的Fv/Fm最低，显著低于其他3种类型叶(P<0.05)，但RM和GM这2种成熟叶之间的Fv/Fm不存在显著差异(P>0.05)。

不同类型青钱柳叶净光合速率(Pn)的差异见图3b。方差分析表明，RF的Pn最低，显著低于RM的Pn(P<0.05)，但与GF无显著差异(P>0.05)，与RF的Pn平均值相比，GF、GM和RM分别高出79%、214%和164%。

图3 红叶青钱柳和绿叶青钱柳PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)和净光合速率(Pn)的差异Fig.3 Differences in Fv/Fm and Pn between red-leaf and green-leaf C． paliurus

2.4 青钱柳叶花色素苷含量与多酚含量的关系

花色素苷含量与其他色素以及多酚含量的相关性分析见表1。叶绿素和类胡萝卜素两类色素含量与花色素苷含量呈显著负相关，但花色素苷含量与单宁和黄酮两类物质含量呈现显著正相关。叶绿素和类胡萝卜素两类色素含量显著正相关(P<0.01，R2=0.856)，单宁和黄酮两类物质含量也显著正相关(P<0.01，R2=0.506)，但叶绿素和类胡萝卜素含量与多酚类物质含量(黄酮和单宁)均为显著负相关。

表1 青钱柳叶色素含量与多酚类物质含量的相关性分析(n=60)Table 1 The correlation analysis of pigment content and polyphenols content in leaves of C． paliurus(n=60)

回归分析表明，青钱柳叶类胡萝卜素和叶绿素含量与花色素苷均呈现显著幂函数相关(P<0.01)，R2分别为0.24和0.19，前两者含量随花色素苷含量上升均呈现逐渐平缓的下降趋势(图4a、4b)。单宁含量和黄酮含量与花色素苷含量均存在显著二项式相关(P<0.01)，R2分别为0.07和0.15，前两者含量随花色素苷含量上升呈现先上升后下降的趋势(图4c、4d)。

图4 青钱柳叶花色素苷含量与叶绿素含量、类胡萝卜素含量、单宁含量和黄酮含量的相关性回归分析Fig.4 Regression analysis of the correlation between relative anthocyanin content and chlorophyll,carotenoid,tannin and flavonoid content in C．paliurus leaves

2.5 青钱柳叶色素含量与光合特性的关系

青钱柳叶花色素苷、叶绿素、类胡萝卜素、单宁和黄酮含量与Fv/Fm的相关性分析见表2。Fv/Fm和花色素苷不存在相关关系(P<0.05)，但Fv/Fm和类胡萝卜素含量、叶绿素含量分别呈极显著(P<0.01)和显著相关 (P<0.05)；Fv/Fm和单宁含量极显著负相关(P<0.01)，和黄酮含量显著负相关(P<0.05)。

表2 青钱柳叶色素及多酚含量与Fv/Fm(n=24)及净光合速率(n=12)的相关性分析Table 2 The correlation between the contents of pigment and polyphenols or Fv/Fm (n=24) as well as between the contents of pigment and Pn (n=12) in the leaves of C． paliurus

青钱柳叶(RF、RM、GF和GM)的花色素苷含量、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、黄酮含量、单宁含量与Pn之间的相关性分析见表2。Pn和花色素苷含量呈显著负相关，而与单宁含量不相关，与黄酮含量显著负相关(P<0.05)；与类胡萝卜素含量、叶绿素含量呈极显著正相关(P<0.05)。

3 讨 论

本研究结果表明，RF的花色素苷含量显著高于其RM、GF和GM，但其叶绿素含量低于其他3种类型叶，这是红叶青钱柳新叶泛红的主要原因。自6月末到8月末，RF由红转绿的过程中，花色素苷和叶绿素含量均呈现下降的趋势，由此推断花色素苷含量的下降是这一时期青钱柳新叶变绿的关键原因，袁明等[26]和路买林等[27]对其他红叶树叶色转绿的原因也得出相同结论，而花色素苷含量逐渐下降的原因可能是高温降低了花色素苷的稳定性，加速了其分解[28-29]。此外，由于RF从6月初到8月末，花色素苷浓度呈下降趋势，但其浓度均处于较高的水平而呈现深浅不一的红色，因此红叶青钱柳在观赏中可归为“常色叶树种”，具有较长的观赏期，相对绿叶青钱柳具有更丰富多变的景观效果。

本研究发现，RF的单宁含量在多数时候显著高于其他3种类型叶(P<0.05)，且RF黄酮含量在多数时候也高于其他3种类型叶。以往研究认为一些黄酮和单宁类物质被认为是花色素苷的辅色素，可以增强其稳定性[30-31]，近年的研究表明植物幼叶中高浓度的水解单宁可以抑制过氧化物酶介导的花色素苷降解，并可以通过辅色作用增加花色素苷的稳定性[32]。因此，本研究中黄酮和单宁两类多酚化合物同时在青钱柳红色新叶相对富集具有一定合理性。史宝胜等[33]发现遮阴后光照处理使得紫叶李叶花色素苷、类黄酮、多酚三者含量均急剧上升。但黄酮、单宁和花色素苷含量并非线性相关，而是花色素苷在相对低浓度范围时，其含量和单宁、黄酮含量呈现正相关，而超过一定范围后，随着花色素苷含量升高，黄酮、单宁含量呈现下降趋势，这与Gong等[7]的研究结果有差异，可能由于研究对象种类和数量的差异导致。本次研究对象是青钱柳种内红、绿叶表型个体，而Gong等[7]的研究对象是不同科、属、种的红、绿色新叶表型树木类群研究。此外，7、8月叶片黄酮含量较高时，花色素含量最低，这可能是其他一些黄酮类物质在高浓度时，其与花色素苷的共显色作用同花色素苷自聚合效应发生竞争，导致其稳定性降低[34]。

不少研究指出，由于叶绿素含量较低，对光能的吸收转化能力较弱，相比成熟叶往往更易遭受强光和高温的胁迫，夏季过度的光照甚至会引起光氧化损伤[35]。黄酮类物质(尤其是花色素苷)被认为起到抵御强光和高温胁迫的作用[36]。本研究结果表明，RF的Fv/Fm在7月25日和8月30日均低于其他3种类型叶，在8月30日差异达到显著性水平(P<0.05)，而这一时期RF的花色素苷和黄酮含量均高于其他3种类型叶，说明青钱柳花色素苷和黄酮并不能在高温强光环境下起到显著的保护效果。Lee等[37]对杧果和咖啡红色新叶的解剖发现，花色素苷集中分布于靠近叶片下表皮的位置，并由此推测花色素苷与光合作用和光保护并无直接联系；Dominy等[38]调查了新加坡、墨西哥和哥斯达黎加的几处热带林分延迟绿化树种发现，受到更强烈光照的林冠上层树叶并没有比下层树叶含有更多的花色素苷，这说明花色素苷的光保护作用需要更多深入的试验验证。

红色新叶积累大量对光合作用没有贡献的花色素苷，本研究发现RF的Pn低于其他3种类型叶，但和GF无显著差异(P>0.05)，说明青钱柳红色新叶延迟绿化策略而带来的光合损失较小，这与李小康[39]对中红杨和亲本2025的Pn差异研究结果一致。庄猛[40]研究发现红叶桃和红叶李的Pn在春、夏季显著低于绿叶桃和绿叶李，而在秋季红叶与绿叶品种间没有显著差异(P>0.05)；也有研究发现红叶或紫叶品种虽然有的时段Pn低于绿叶桃，但其全天的净光合总值大于绿叶品种[41]。本研究的相关性分析表明，花色素苷含量与Pn为负相关，与前人的结果[42-43]一致。树木的光合作用主要依靠成熟叶，因此红叶青钱柳和绿叶青钱柳两类青钱柳树木整体的光合差异还需进一步研究。此外，关于红叶青钱柳生长、代谢生理以及遗传方面的差异和抗性、生态以及生产实际方面的意义，未来还需进一步深入探讨。