基于网络药理学预测黄甲软肝颗粒抗肝纤维化作用及验证研究

蔡 强 张 苗 黄朝情 张 荣 杨 蕾 王宗权

1 广州中医药大学(广州 510000)

2 北京盈科瑞药物研究院有限公司(北京 100000)

3 盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司，国家中药现代化工程技术研究中心新型递药系统分中心，广东省雾化吸入制剂工程技术研究中心(珠海 519000)

肝纤维化是一种严重的健康问题，在全球范围内普遍存在且预后较差，可响应几乎所有引起慢性肝损伤的原因，包括酒精中毒、非酒精性肝脂肪性肝炎、慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病[1]。肝纤维化的特征是由于细胞外基质产生和降解之间的不平衡，导致肝内的沉积过多[2]。肝星状细胞的激活已被确认为肝纤维化发展中的关键事件，它调节细胞外基质的大量生产和分泌[3]。肝纤维化被认为是可逆的病理生理过程，其晚期会导致肝硬化[4]、肝衰竭和门脉高压，可能需要进行肝移植。肝纤维化的预防和逆转是预防和治疗慢性肝病的关键步骤。当前，仍然没有批准用于人类的有效抗纤维化药物。因此，开发有效且安全的抗纤维化药物并揭示其潜在机制至关重要。中药由于其疗效好，不良反应少而在中国的临床实践中一直使用了数千年，已成为当前医疗体系中不可或缺的一部分[5]。临床证明中医在预防和治疗肝纤维化和肝硬化方面具有独特的功效和优势。

黄甲软肝颗粒是纯中药复方制剂，来源于北京模式口中医院刘源院长祖传多年的秘方，后经刘源院长几十年临床实践总结而得。由黄芪、鳖甲、灵芝等10 味中药组成。具有益气舒肝，活血软坚的功效。用于肝纤维化和早期肝硬化，脾虚肝郁，气血瘀阻证。症见胁肋刺痛或胀痛，食欲不振，脘腹胀满，大便溏烂，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脉弦。但目前尚未揭示黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的作用机制。

网络药理学基于系统生物学和网络分析的原理，由于各种生物信息学资源的迅速发展，网络药理学方法已成功应用于中药有效成分及其分子机理的发现。因此，基于网络药理学的中药研究值得探索。本研究应用网络药理学方法研究黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化中的活性成分和作用机制，为黄甲软肝颗粒减轻肝脏纤维化和恢复肝功能的功效机制研究提供一定的的方向。

1 材料与方法

1.1 黄甲软肝颗粒活性成分的获取及靶点刷选

查找相关中药活性成分依托中药系统药理学分析平台(TCMSP数据库：http://tcmspw.com/tcmsp.php)[6]收集黄甲软肝颗粒全方中 10味中药黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草、叶下珠的化学成分，根据口服生物利用度和类药性筛选，筛选阈值分别为口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18[7]。通过 TCMSP 数据库寻找与活性成分相关的靶标蛋白，通过Unitprot数据库(http://www.Unitprot.org/)查询靶标蛋白所对应的基因名称，选择人类的靶点蛋白，最终确定黄甲软肝颗粒的活性成分及其对应靶点。

1.2 肝纤维化靶点刷选

在OMIM数据库、TTD数据库、GeneCards数据库、Disgenet数据库[8]中输入“Liver Fibrosis”，收集肝纤维化的相关靶点，将所得靶点取并集，并将重复项删除，以得到肝纤维化的相关靶标信息。

1.3 “成分-靶点”网络构建与分析

将所得活性成分对应靶标蛋白与肝纤维化的相关靶点进行映射，即两者取交集，得到黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的预测靶点，利用Cytoscape软件构建构建“C(成分)-T(靶点)”作用网络图。

1.4 GO富集与KEGG通路富集分析

为了分析黄甲软肝颗粒作用于肝纤维化的生物学过程和信号通路传导过程，继而进一步预测药物机制，采用 DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)[9]对网络中的靶点进行 GO 富集与KEGG通路富集。通过Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)对富集分析结果进行可视化处理。

1.5 SD大鼠体内实验验证

1.5.1 实验动物 雄性SD大鼠36只，SPF级，体质量180～220 g，由广州中医药大学实验动物中心提供(实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2018- 0085；实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2018- 0034。

1.5.2 药物与试剂 黄甲软肝颗粒：盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司；阳性对照药为水飞蓟素(纯度>80%)；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色试剂盒(批号C0105)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)检测试剂盒(批号C010- 2- 1)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)检测试剂盒(批号C009- 2- 1)：南京建成生物工程研究所。

1.5.3 主要仪器 分析天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；高速低温离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；多功能酶标仪：PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH；显微镜:日本Olympus公司。

1.5.4 动物实验 实验大鼠在标准环境温度及湿度均适宜的SPF级动物房饲养，饲养期间每天日照12 h。适宜1周后，将大鼠随机分成6组：对照组、模型组、水飞蓟素组、黄甲软肝颗粒低、中、高剂量组。每组6只。除正常组外，其余各组采用灌胃给予 20% CCl4橄榄油溶液(3 mL/kg)，正常组给予相应橄榄油，每周2次，连续10周，诱导肝纤维化大鼠模型。于造模第2天起，给药组分别灌胃给予相应的受试药物，水飞蓟素组按照每日25 mg/kg的剂量灌胃给予水飞蓟素，黄甲软肝颗粒低剂量组按照每日1.16 g/kg的剂量灌胃给予黄甲软肝颗粒，黄甲软肝颗粒中剂量组按照每日2.32 g/kg的剂量灌胃给予黄甲软肝颗粒，黄甲软肝颗粒高剂量组按照每日4.64 g/kg的剂量灌胃给予黄甲软肝颗粒，正常组和模型组分别灌胃给予相应饮用水，每天1次，连续10周。末次给药后，过夜禁食不禁水，大鼠麻醉后，腹主动脉取血，离心分离血清，-80 ℃保存。各组大鼠处死后取肝脏，称取肝脏重量，切取肝脏大叶边缘相同部位与4%多聚甲醛中固定，用于病理学观察，其余部分分装于冻存管，置-80 ℃保存。

1.5.5 肝脏指数的测定 肝脏指数：肝指数(%)=肝湿重/末次体质量×100(%)。

1.5.6 血清AST和ALT的测定 血清直接取样进行测定，按照AST和ALT试剂盒说明，采用微板法检测血清中AST和ALT含量，评价各组大鼠肝功能。

1.5.7 大鼠肝脏组织病理学观察 用4%多聚甲醛固定肝脏后，依次经乙醇常规脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，制备4 μm厚度病理组织切片，进行HE染色，观察组织病理学。

1.5.8 数据分析 采用GraphPad Prism软件进行Dunnett多重比较检验，统计分析结果以SEM均值表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 活性成分与靶点获取

通过TCMSP数据库收集黄甲软肝颗粒的活性成分基本信息，以利用度≥30%和药物相似度≥0.18%筛选，剔除掉未找到靶点的化学成分，得到活性化合物208个，其中黄芪 20个、鳖甲0个、葛根 4 个、柴胡17个、灵芝61个、赤芍29个、丹参65个、三七8个、鸡骨草4个、叶下珠0个；相关靶标共2 398个，见表1。将活性成分和相关靶标综合筛选保留唯一值，共搜集到117个活性成分，266个对应靶点，利用Cytoscape软件构建“活性成分-对应靶点“网络，见图1。

图1 “活性成分-对应靶点“网络

表1 黄甲软肝颗粒“中药-活性成分-相关靶标”信息

2.2 疾病靶点筛选结果

在OMIM数据库、TTD数据库、GeneCards数据库、Disgenet数据库中检索肝纤维化所得结果进行并集，删除重复项，得到肝纤维化相关靶点6 398个。

2.3 “成分-靶点”构建与结果分析

将所得到的黄甲软肝颗粒的药物靶点与肝纤维化相关靶点进行映射，得到161个共有靶点，对应黄甲软肝颗粒活性成分117个，利用Cytoscape软件构建的C(成分)-T(靶点)网络见图2。 靶点数排前10位的成分为槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、7-O-methylisomucronulatol、甾醇(beta-sitosterol)、二氢丹参内酯(dihydrotanshinlactone)、丹参酮IIA(tanshinone iia)、刺芒柄花素(formononetin)、糖甙(isorhamnetin)、4-亚甲丹参新酮(4-methylenemiltirone)，见表2，这些可能为黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的有效成分。靶点对应基因排前10位的为PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，见表3，将映射所得的161个靶点利用String作PPI网络，见图3，上面所得到的前10个靶点均包含在主要靶点内，表明这些基因可能为黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的关键基因。

图2 “黄甲软肝颗粒C(成分)-T(靶点)”网络

图3 “成分-靶点 PPI”网络

表2 黄甲软肝颗粒靶点数排名前10位成分信息

表3 靶点对应基因的前10位

2.4 GO功能富集分析

采用 DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对网络中的蛋白进行 GO 富集分析。GO 是为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划，旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO 有 3 个分类：(1)分子功能，描述基因产物在分子生物学上的活性；(2)生物学过程，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的过程；(3)细胞组分，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中，表明基因产物在什么地方起作用。通过根据显著性程度P<0.05(P值由小到大)，GO 分析共包含 960条富集结果，其中生物过程相关的条目最多，有845个，主要涉及细胞凋亡的调控、抗凋亡、抗炎症反应、抗氧化应激反应、调节细胞因子的产生、NF-κB通路调控、MAPK通路调控、激活蛋白激酶活性、调节白介素12的产生、诱导细胞凋亡、调节免疫球蛋白的分泌、调节肿瘤坏死因子的产生、转化生长因子β受体信号通路、过氧化物酶活性等。通过文献查询，选出与之相关性较多的，通过Omicshare对分析结果进行可视化处理，见图4。

图4 GO功能富集分析图

2.5 KEGG分析

利用DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行通路富集分析。在 DAVID 的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“ OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，背景也选择“Homo Sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合，获得通路富集结果。对筛选出的核心靶点蛋白进行 KEGG 通路富集分析，共获得 87条富集结果。根据显著性程度P<0.05(P值由小到大)，筛选出69条通路在肝纤维化方面具有作用。其中前20条通路为乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、TNF信号通路、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恰加斯病(美国锥虫病)、破骨细胞分化、慢性粒细胞白血病、Toll样受体信号通路、弓形虫病、T细胞受体信号通路、甲型流感、丙型肝炎、百日咳、胶质瘤、HTLV-Ⅰ感染、NOD样受体信号通路、结核。其结果见图5。其中，Y 轴代表通路名称，X 轴代表基因数(count，即目标基因中属于这个通路的基因的数量)，气泡颜色代表富集显著性，即P值的大小。在69条通路中近期研究新型热点通路包括ErbB信号通路、胞质DNA传感途径、Rap1信号通路等。

图5 KEGG通路富集分析

2.6 动物实验初步验证

2.6.1 大鼠体重与肝脏指数 实验结束末，与正常对照组比较，模型组大鼠体质量增长明显较低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，给药组中水飞蓟素组和黄甲软肝中、高剂量组体重增加，且高剂量组具有统计学差异(P<0.05)。与正常对照组相比，模型组大鼠肝脏指数明显增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，水飞蓟素组、黄甲软肝颗粒各剂量组的肝脏指数显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明黄甲软肝颗粒具有很好的改善肝脏指数作用(见图6)。

图6 黄甲软肝颗粒对肝纤维化大鼠体质量及肝脏指数的影响(n=6)

2.6.2 黄甲软肝颗粒对大鼠肝功能的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中ALT和AST活性显著升高(P<0.01)；与模型组相比，水飞蓟素组和黄甲软肝颗粒各剂量组大鼠血清中ALT和AST的水平显著降低(P<0.05)，提示黄甲软肝颗粒具有改善大鼠肝功能的作用，见图7。

图7 黄甲软肝颗粒对肝纤维化大鼠血清中ALT和AST的影响 (n=6)

2.6.3 大鼠肝脏病理形态学结果 正常大鼠肝脏组织切片显示肝中央静脉及周围肝细胞结构正常。在CCl4处理的大鼠中，观察到气泡性变异增多、炎症细胞浸润、纤维状等变化，证明肝纤维化建立成功。而黄甲软肝组和水飞蓟素组可有效缓解病变，气泡性变异明显减轻，炎症细胞浸润减少，提示给药组肝纤维化呈现很好的好转，见图8。

图8 黄甲软肝颗粒对肝纤维化大鼠肝组织病理的影响

3 讨 论

本研究运用网络药理学，探讨了黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的作用网络与潜在机制，研究显示，黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的可能关键成分10个，为槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-O-methylisomucronulatol、甾醇、二氢丹参内酯、丹参酮IIA、刺芒柄花素、糖甙、4-亚甲丹参新酮，关键靶点10个，为PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，GO与KEGG通路富集分析发现，主要通路为调节炎症反应、对氧化应激的反应、MAPK活性、诱导细胞凋亡、ErbB信号通路、VEGF信号通路、胞质DNA传感途径、Rap1信号通路等。

肝纤维化是肝组织抗损伤的修复过程，早期对肝组织的损伤修复有重要的防御作用。因此，在肝纤维化发生的早期阶段，此时以病因治疗及抗炎保肝治疗为主，进展期和显著肝纤维化期以及肝硬化期时需要进行抗肝纤维化治疗。慢性炎症反应是纤维化形成的前提及进展的驱动力，抑制肝脏炎症、肝细胞保护和抗氧化是抗肝纤维化的重要措施[10- 11]。 从图1中可以发现黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化中包括IL- 1β、IL- 6、IL- 2、 TNF、IL- 4、IL- 10、PTGS1、PTGS2等因子，这些都是在炎症中起到主要作用的炎症细胞因子，说明炎症与肝纤维化的发生发展关系密切。

目前，肝活检组织病理学检查是肝纤维化诊断的“金标准”[12]，血清中 AST和ALT可以反映肝细胞的损伤情况，两者比值与肝纤维化程度、肝功能损伤之间密切相关[13]，而肝脏指数可作为大体确定肝脏病变程度的参考[14]。本次体内动物实验，通过肝脏指数、血清中ALT和AST指标、肝组织病理学比较，水飞蓟素组和黄甲软肝颗粒各剂量组对肝纤维化均有一定的改善作用。

在本阶段，我们通过运用网络药理学技术对黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化进行了系统分析，初步揭示了黄甲软肝颗粒治疗肝纤维化的潜在活性成分、作用靶点和潜在作用机制；通过动物实验初步验证，黄甲软肝颗粒可改善CCl4致肝纤维化大鼠的体重、肝脏指数和血清生化指标，减轻大鼠肝病理损伤，说明黄甲软肝颗粒对CCl4诱导的大鼠肝纤维化具有很好的保护作用。我们后续将系统地进行动物实验进一步证实其功效，并对其机制进行验证。