姜黄素对系统性红斑狼疮小鼠氧化应激的影响及其保护作用

刘志勇 褚爱春

系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病，其特点是患者体内存在大量自身抗体，特别是抗核抗体，会导致肾脏、肺和心脏等多器官损伤[1-2]。目前认为SLE的病因是多因素的，包括遗传、激素和环境等，但其分子机制尚不明确[3]。SLE患者和动物模型的研究表明氧化应激在SLE发病中起重要作用[1]。活性氧自由基(ROS)的大量产生和氧化还原状态改变可能是SLE产生自身抗体和各种临床特征的重要因素[4]。姜黄素是从植物姜黄中提取的一种多酚化合物，据报道其可减轻炎症，抑制自身免疫反应，是一种安全高效的抗炎和抗氧化药物[5-7]。既往研究结果表明姜黄素可通过上调或下调相关基因的表达来诱导其产生抗氧化酶，从而改善氧化应激，发挥抗氧化作用[8-9]。目前发现姜黄素对系统性硬化症[10]、类风湿关节炎[11]等多种疾病具有良好的治疗效果。本研究采用姜黄素对SLE小鼠模型进行干预，观察小鼠血清氧化与抗氧化应激指标的变化，探讨姜黄素对SLE的抗氧化效果及其保护作用。

材料与方法

1.材料：6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠各20只，均购自于中国科学院上海实验动物中心，在有正常食物和水的环境中适应性饲养1周，室温22～25 ℃，白天/黑夜12 h循环。姜黄素购自美国Sigma-Aldrich公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司，一氧化氮(NO)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司，小鼠抗双链DNA(ds-DNA)抗体检测试剂盒购自上海瑞番生物科技有限公司，水合氯醛晶体由武汉大学人民医院药剂科提供。

2.方法

(1)动物分组和干预措施：将20只BALB/c小鼠随机分为正常组10只和正常干预组10只；将20只MRL/lpr小鼠随机分为模型组10只和模型干预组10只。正常组和模型组小鼠不做任何处理。正常干预组和模型干预组小鼠用混合有姜黄素(500 mg·kg-1·d-1)的玉米油0.5 ml灌胃，连续4周。姜黄素用量根据参考文献[12]按体重换算确定。

(2)标本采集：按照上述措施处置4周后，用腹腔注射4%水合氯醛的方法麻醉小鼠，打开胸腔，直视下用1 ml空针注射器于心尖部采血0.5～1.0 ml，常规离心5 min，吸取上层血清置于试剂管中，于-80 ℃冰箱冻存备用。在动物处死前1天留取尿液标本，每只小鼠分别放在1个代谢笼中，收集24 h尿液，标本置于-20 ℃冰箱保存用于总尿蛋白排泄分析。

(3)血清氧化应激相关指标水平测定：取室温复融的上清液0.1 ml，采用硝酸还原酶法测定NO水平，按试剂盒操作步骤混匀标本，于550 nm波长处读取各标本OD值，然后计算各样本NO水平。MDA水平测定是基于分光光度法测定硫代巴比妥酸(TBA)和MDA形成的粉红色产物，取1 ml上清液，加入75 μl 0.10 M乙二胺四乙酸(EDTA)和250 μl的1% TBA溶液，沸水浴15 min，于532 nm处测定OD值，根据试剂盒说明书计算MDA水平。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD水平，根据试剂盒操作要求处置样品，于550 nm波长处测定各标本OD值，计算SOD水平。采用化学比色法测定GSH-PX水平，于412 nm处测定各标本OD值，计算GSH-PX水平。

(4)小鼠抗ds-DNA抗体水平测定：采用双抗夹心ELISA法测定血清抗ds-DNA抗体水平，将生物素标记抗体加入待测血清标本中，37 ℃温箱孵育1 h，洗净后加入80 μl亲和链酶素-辣根过氧化物酶(HRP)，振荡混匀，在37 ℃温箱孵育30 min；洗净后加入50 μl A、B底物，摇匀，继续在37 ℃温箱孵育后立刻加入终止液，于450 nm波长处计算结果代表抗ds-DNA抗体水平。

(5)小鼠24 h尿蛋白水平测定：根据试剂盒说明书按步骤进行测定，采用酶标仪(Bio-rad,Japan)于450 nm波长处测定各管OD值，计算各标本24 h尿蛋白水平。

结 果

4组小鼠血清氧化应激相关指标、抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平比较：4组小鼠血清NO、MDA、SOD、GSH-PX、抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组小鼠血清NO、MDA、抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平均明显升高，而血清SOD和GSH-PX水平均明显下降(P<0.01)。与模型组比较，模型干预组小鼠血清NO、MDA、抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平均明显下降，而血清SOD和GSH-PX水平均明显升高(P<0.05)。正常组和正常干预组小鼠上述指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组小鼠血清氧化应激相关指标、抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平比较

讨 论

目前研究认为氧化应激可能是SLE病理特征中细胞死亡信号异常暴露和反应的基础。SLE患者免疫系统异常激活，氧化应激触发凋亡和坏死细胞释放核碎片，刺激抗核抗体产生，进而引发炎症和器官损伤[13]。SLE的发生发展与ROS的过度产生及无效清除有关。研究表明，SLE患者血液中存在不同成分的ROS生成增加或细胞内还原性谷胱甘肽水平降低，而使用抗氧化剂恢复氧化还原平衡或通过摄入抗氧化营养素(如维生素A、C、胡萝卜素等)减少氧化应激的影响，可减轻SLE患者各种氧化应激诱导的并发症[1]。

研究发现姜黄素是一种强效的抗氧化剂，其正甲氧基提供的氢可与ROS发生氧化反应，有助于清除循环系统中的ROS[14]。姜黄素还能增加抗氧化酶的表达，如SOD、GSH-PX和过氧化氢酶等，且姜黄素能通过激活细胞内的抗氧化基因来清除ROS，保护细胞免受氧化应激诱导的损伤，从而降低细胞毒性，减弱继发效应[15]。既往动物实验已证实姜黄素对肝脏和心脏等器官具有明显的抗氧化保护作用。在Macías-Pérez等[16]的一项关于肝损伤的动物实验中发现，姜黄素能够逆转仓鼠肝实质损伤。Naghdi等[17]研究也发现姜黄素具有较强的抗氧化性能，有助于改善1型糖尿病诱导的氧化应激和调节糖尿病诱导的心脏组织损伤。

在氧化应激损伤生物膜后，MDA能够反映不饱和脂肪酸过氧化的情况，而过量表达的NO能使微小血管渗透性增高，破坏局部组织器官微循环。发挥抗氧化作用的SOD可氧化还原ROS，维持机体氧化应激平衡；GSH-PX则可清除氧化应激产生的过氧化物，保护机体免受损伤[18]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组小鼠血清NO和MDA水平明显升高，而血清SOD和GSH-PX水平明显降低，表明SLE小鼠体内存在氧化应激。同时，我们还发现模型组小鼠血清抗ds-DNA抗体及24 h尿蛋白水平与正常组相比也明显升高，提示氧化应激与SLE的病情进展及肾脏损伤紧密相关。然而用姜黄素干预4周后，模型干预组小鼠血清SOD和GSH-PX水平均高于模型组，而NO和MDA水平均低于模型组，表明姜黄素能够抑制SLE小鼠的氧化应激反应。此外，本研究还发现，与模型组比较，模型干预组小鼠血清抗ds-DNA抗体和24 h尿蛋白水平明显降低，表明姜黄素对SLE模型小鼠有明显的治疗效果。这与既往研究结果一致，Elena等[12]发现姜黄素能调节SLE小鼠的自身免疫活动，并能减轻肾损伤；Abdul Kadhim等[19]在环孢素A所致肾损伤的动物实验中发现，姜黄素可明显降低大鼠血清MDA水平，显著提高抗氧化酶活性，减轻环孢素A的肾毒性，并使改变的肾脏形态恢复正常。正常干预组和正常组小鼠上述各项指标比较差异均无统计学意义，表明姜黄素对正常小鼠无明显不良反应。

综上所述，SLE模型小鼠存在氧化应激的失衡，而姜黄素干预减轻了SLE小鼠的氧化应激反应，改善了SLE相关的肾损伤，发挥了抗氧化保护作用。因此，抗氧化干预可能是SLE的有益辅助治疗方式。