短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对拟茎点霉的拮抗作用

潘 敏，朱明龙，谈家金，李亮亮，郝德君

(南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

近年来，为了减少化学农药带来的环境问题，在防治植物病虫害过程中微生物的使用逐渐增多。短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)是应用较为广泛的一种生防微生物[1-2]，对一些常见的植物病害，如稻瘟病[3]、鹰嘴豆根腐病[4]、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等[5]具有显著的防治效果。此外，短小芽孢杆菌亦能在促进植物生长和生物降解方面发挥较好功效[6]。因此在农业生产中，应用芽孢杆菌菌剂代替化学农药既能抑制植物病害的发生，又能在一定程度上维持生态系统的稳定，降低化学农药对人类健康和环境的不良作用。

2016年李亮亮等[7]从马尾松茎部分离筛选了1株具有高效杀线活性的短小芽孢杆菌LYMC-3，发现LYMC-3菌株具有内生性，能够在马尾松体内良好地定殖和传导，其无菌发酵液具有很强的杀线作用，能够使死亡的松材线虫虫体全部消解[8]。为进一步了解LYMC-3菌株的生防潜力，笔者对LYMC-3菌株的抑菌谱进行了测定，以期明确其对病原菌拟茎点霉(Phomopsismacrospora)的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本研究共选取8种病原菌株：松球壳孢菌(Sphaeropsissapinea)，寄主为黑松(Pinusthunbergii)；松树脂溃疡病菌(Fusariumcircinatum),寄主为加勒比松(Pinuscaribaea)；金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)，寄主为杨树(Populussp.)；拟茎点霉(Phomopsismacrospora)，寄主为杨树(Populussp.)；七叶树壳梭孢菌(Fusicoccumaesculi)，寄主为杨树(Populussp.)；拟盘多毛孢(Pestalotiopsistheae)，寄主为茶树(Camelliasinensis)；山茶炭疽菌(Guignardiacamelliae)，寄主为茶树；葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothiorella)，寄主为苹果(Malusdomestica)。以上8种病原菌株均保存在南京林业大学病理学实验室。

短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)LYMC-3菌株，分离自洛阳隋唐植物园马尾松(Pinusmassoniana)茎部，已保存于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2016775。

1.2 供试培养基

细菌菌种活化培养基为营养琼脂(NA)培养基，其组分为牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂 20 g，加水定容至1 L，调pH 至7.2。

发酵培养基为营养肉汤(NB)培养基，其组分为牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g，加水定容至1 L，调pH 至7.2。

真菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，由去皮马铃薯200 g、加水煮沸20 min纱布过滤后加入葡萄糖20 g、琼脂20 g组成，加水定容至1 L。

1.3 抑菌性测定方法

1.3.1 LYMC-3菌株抑菌谱测定

将LYMC-3菌株划线接种至PDA平板两侧，在平板中央分别接种8种病原真菌大菌块(接种直径为5 mm)[9]，同时设置无LYMC-3菌株划线、接种病原真菌的平板为对照，以上每个处理重复3次。

将处理后的平板放置于25 ℃恒温培养箱中培养4 d，观察各病原真菌生长状态及抑菌带的有无，并测定抑菌带宽度。

1.3.2 LYMC-3菌株对拟茎点霉抑菌率测定

取100 mL容量瓶若干，每瓶盛装NB培养基50 mL，对培养基高温灭菌。挑取纯化过的LYMC-3菌株单菌落进入摇瓶中，在28 ℃、200 r/min的条件下摇培2 d，即得发酵液。在4 ℃条件下，以10 000 r/min的转速离心20 min，将离心后上清液过滤，所得溶液为无菌滤液。

将无菌滤液与PDA培养基以1∶4的体积比混合制备平板，以NB培养基代替无菌滤液为对照。将直径为5 mm的拟茎点霉菌块接种于直径为90 mm的平板中央。每个处理设置5个重复。

将处理过的平板置于25 ℃恒温培养箱中培养，4 d后测定滤液对病原菌的生长抑制率(抑菌率)[10]。

抑菌率=

(1)

挑取处理后的拟茎点霉的菌落边缘菌丝于PDA培养基上培养，同时在显微镜(Zeiss Axio Imager A2m)下观察菌丝的形态。

1.3.3 LYMC-3菌株对拟茎点霉分生孢子萌发抑制率测定

对拟茎点霉孢子萌发的抑制率测定采用凹玻片法。在25 ℃下培养5～7 d后，用无菌水冲洗平板获取拟茎点霉孢子，过滤离心再根据处理需求用无菌水稀释，最终获得新鲜孢子悬浮液。用血球计数法(25×16个方格)测定孢子浓度[11]。吸取20 μL分生孢子悬浮液(浓度约1×106个孢子/mL)与20 μL的LYMC-3菌株发酵滤液(抑菌率测定所用发酵液的5倍稀释)混合，滴加在凹玻片中央，对照为20 μL NB培养基与20 μL分生孢子悬浮液混合。将各处理凹玻片置于底部层铺湿滤纸的培养皿内，将培养皿置于25℃恒温箱中黑暗培养24 h，观察并记录第4、8、12、24 小时的拟茎点霉分生孢子的萌发情况，参照文献[12]计算分生孢子萌发抑制率和孢子悬浮液浓度：

(2)

(3)

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析，采用Excel 2010计算抑菌圈平均直径并进行数据整理和作图，使用Photoshop CC2020软件进行照片处理。

2 结果与分析

2.1 LYMC-3菌株对8种病原菌的抑菌谱

LYMC-3菌株对8种病原菌均有抑制作用，且抑菌效果有明显差异(图1)。LYMC-3菌株对拟茎点霉、拟盘多毛孢和葡萄座腔菌具有较强的抑菌作用，这3种病原菌的菌丝在培养基上不能较好扩展，菌落靠近LYMC-3菌株一侧的菌丝不能正常生长，菌落边缘菌丝稀疏，抑菌带明显，分别达到31.4、27.7和21.3 mm。LYMC-3菌株对松球壳孢菌、七叶树壳梭孢菌和金黄壳囊孢菌的抑菌作用相对较弱，抑菌带宽度分别为17.9、17.7和12.5 mm。

A—H.平板对峙的处理组the treatment group of plate confrontation；a—h.各个处理的对照组the control group of each treatment。

而LYMC-3菌株对松树脂溃疡病菌和山茶炭疽菌的抑菌效果最差，其抑菌带宽度分别仅为8.9和4.8 mm。以上结果表明，LYMC-3菌株抑菌谱较广，具有较好的应用前景。

2.2 LYMC-3菌株对拟茎点霉菌丝生长和孢子萌发的抑制作用

由LYMC-3菌株的抑菌效果可知，LYMC-3菌株对拟茎点霉菌丝生长的抑制作用最强。选择该菌以研究LYMC-3菌株对其菌丝生长和孢子萌发的影响。菌丝生长抑制试验结果显示，经LYMC-3菌株处理过的拟茎点霉其平均菌落直径为(25.60±0.67)mm，未处理过的对照组平均菌落直径为(88.40±1.12)mm，两者差异极显著(P<0.01)，LYMC-3菌株对拟茎点霉的抑菌率达到70.36%。拟茎点霉菌丝经LYMC-3菌株处理后，菌丝形态出现异常，表现为菌丝变粗、部分细胞肿胀成泡囊状，菌丝顶端膨大畸形(图2A箭头所示)。挑取处理后的拟茎点霉菌落边缘菌丝于PDA培养基上培养发现，菌丝不能正常生长。

A.发酵滤液处理后的菌丝形态the mycelial morphology after fermentation filtrate treatment；B. 未经处理的菌丝形态 the morphology of untreated mycelium。

孢子萌发试验结果显示，LYMC-3菌株发酵滤液的5倍稀释液有抑制拟茎点霉分生孢子萌发及芽管伸长的作用。随着处理时间的延长，对照组中拟茎点霉孢子萌发率不断提高，在第24小时，对照组孢子萌发率达到100%。处理组前12小时内，孢子萌发抑制率持续下降，这段时间是孢子迅速萌发时期，对照组在这个时间段孢子萌发率从5.49%提高到78.34%，在第12小时，处理组的孢子萌发抑制率达到86.97%。第12～24小时，孢子萌发抑制率有所上升，第24小时孢子萌发抑制率达88.16%(表1)。

表1 短小芽孢杆菌LYMC-3菌株发酵滤液对拟茎点霉分生孢子萌发的影响

LYMC-3菌株发酵滤液对拟茎点霉分生孢子萌发的影响见图3。经LYMC-3菌株发酵滤液5倍稀释液处理的分生孢子几乎未萌发且变形，孢子外形肿大，部分膨胀畸形呈现泡状。其中少数孢子萌发时芽管伸长受到抑制，生长异常。对照孢子均正常萌发，且孢子的芽管伸长也正常。

A.发酵滤液处理后的分生孢子形态 the conidia morphology after treatment of fermentation filtrate；B.未处理的分生孢子形态the morphology of untreated conidia。

3 讨 论

芽孢杆菌是一类营腐生生活的革兰阳性细菌[13]，在自然界中广泛存在,它生长迅速，分离和培养也较为简单。该属细菌嗜温好氧，能产生热稳定的内生芽孢，抗逆能力强、易定殖在植物表面[14]。芽孢杆菌在实际生产中具有贮存期长、施用方法简单等优点，为能广泛应用的植物病害生防细菌。

通过对短小芽孢杆菌LYMC-3菌株的抑菌谱测定，发现LYMC-3菌株的抑菌谱广，对供试的8种病原真菌松球壳孢菌，松树脂溃疡病菌、拟茎点霉、金黄壳囊孢菌、七叶树壳梭孢菌、拟盘多毛孢、山茶炭疽菌及葡萄座腔菌均有一定的抑制作用，说明LYMC-3菌株有很好的生防潜力。

LYMC-3菌株对杨树溃疡病的3种病原菌均有抑制作用，抑制效果由大到小依次为拟茎点霉、七叶树壳梭孢菌和金黄壳囊孢菌，说明短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对杨树溃疡病有一定的生防潜力。颜爱勤等[15]从杨树茎部分离筛选了1株短小芽孢杆菌JK-SX001，发现其对杨树溃疡病菌有显著的抑制作用且对杨树有一定的促生作用。本研究发现了LYMC-3菌株对杨树溃疡病菌存在显著的抑制作用，但其具体生防机制尚不明确，还有待进一步研究。

李亮亮等[8]发现LYMC-3菌株的培养滤液可使松材线虫虫体消解，这对松材线虫病的生物防治具有重要意义。本研究发现短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对多种病原真菌亦有较好的拮抗作用。另据报道，程丹丹[16]从水稻植物体内分离得到短小芽孢杆菌233菌株，发现其对水稻纹枯病菌有较好的拮抗作用。王静等[17]发现短小芽孢杆菌AR03菌株的菌液对烟草赤星病菌和白粉病菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有明显的拮抗作用。曹舜[18]测定了短小芽孢杆菌BS-4菌株对15种病原真菌和8种疫霉菌的拮抗作用及其代谢液对不同病原菌的抑制作用，结果表明BS-4菌株对核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)具有强烈的抑制作用。

短小芽孢杆菌对许多真菌病害如稻瘟病[19]、黑曲霉菌[20]、烟草赤星病菌和白粉病菌[17]等均有良好的防治作用，同时短小芽孢杆菌能诱导植物产生抗病性。连玲丽等[21]发现短小芽孢杆菌菌株EN16能显著提高番茄对青枯病的抗性。Shahzad等[22]发现接种短小芽孢杆菌可以帮助玉米抵御金属元素镉(Cd)的胁迫，能降低Cd对植物的毒害。Zhang等[23]和Xie等[24]发现短小芽孢杆菌可以通过促进甘草G5幼苗次生代谢物的积累，减轻干旱胁迫对其生长的不利影响，从而提高甘草G5幼苗对干旱胁迫的耐受性。另外，Farid等[25]发现短小芽孢杆菌能有效抑制草莓根腐病的发生，同时能促进草莓的生长和提高其产量。这为研究LYMC-3菌株的生防潜力提供了一定的参考，但其在生防和其他方面应用前景如何还需深入研究。