真菌耐药机制及治疗对策的研究进展

杜 霞

（深圳龙城医院神经康复科，广东 深圳 518000）

真菌是地球上最具影响力的真核微生物之一，除了在环境中普遍存在外，许多种真菌被认为是人体不同部位（包括皮肤、肺、泌尿生殖道、口腔和胃肠道）正常菌群的一部分，对人体健康有重要作用[1]。但当免疫系统受损时，共生真菌可转化为侵入性病原体，导致侵入性真菌感染[2]。真菌致病不仅仅局限于急性和慢性感染，研究发现，某些真菌的定植还与胰腺癌进展和酒精性肝硬化有关[3-4]。现在越来越多的耐药真菌出现，耐药真菌感染造成了高病死率并增加了患者的经济负担，因此需要在临床工作中建立抗真菌管理计划，加强真菌鉴定、抗真菌药敏试验和治疗药物监测的研究，以最大限度地减少耐药真菌的出现。目前，人类对真菌耐药机制的了解有限。本文就真菌耐药的机制、治疗药物监测和新型抗真菌药物的开发等研究的进展综述如下。

1 抗真菌药物的使用与真菌耐药

抗真菌药物按化学结构可分为唑类、多烯类、棘白菌素类、尼可霉素类、氟尿嘧啶类、鞘磷酯类等，其中唑类分咪唑和三唑两个亚类。临床常用的抗真菌药物包括：三唑类，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等；棘白菌素类，如卡泊芬净、米卡芬净；多烯类，如两性霉素B。

最早的咪唑类药物克霉唑和咪康唑对人类肝脏细胞色素氧化酶（CYP）有抑制作用，因而使用受到限制。20 世纪90 年代早期，三唑类药物氟康唑和伊曲康唑开始应用，显示出了更好的药代动力学特征和更广泛的抗真菌活性，并且对人类细胞色素氧化酶P450（CYP450）系统的抑制作用降低[5]。21 世纪初，伏立康唑出现，与氟康唑或伊曲康唑相比，伏立康唑的抗真菌作用更强[5]。三唑类药物与念珠菌中的ERG11 基因和曲霉菌中的Cyp51A 基因结合，中断麦角甾醇的合成，而麦角甾醇是真菌细胞膜的重要成分。棘白菌素类药物则以FKS 基因编码的β-1,3-D-葡聚糖合酶的催化亚基为靶点，干扰细胞壁主要成分β-1，3-D-葡聚糖的合成[5]。多烯类药物与真菌细胞膜中的麦角甾醇结合，通过在细胞膜上形成孔道导致细胞内外渗透压改变，使细胞死亡[5]。抗真菌药物能抑制某些种类的真菌生长，例如氟康唑对念珠菌的抑制，棘白菌素类药物对曲霉菌的抑制。目前，具有抗霉菌活性的三唑类药物伏立康唑、泊沙康唑和伊沙武康唑被推荐为治疗侵袭性曲霉菌感染的一线抗真菌药物[6]。棘白菌素类药物米卡芬净和卡泊芬净被推荐为治疗念珠菌感染的一线抗真菌药物[7]。由于多烯类药物具有潜在的肾毒性和肝毒性，因此使用谨慎，更常用于治疗难治性念珠菌和曲霉菌感染。棘白菌素类药物对新型隐球菌不敏感[7]，因此，新型隐球菌感染治疗通常使用两性霉素B、5-氟胞嘧啶和氟康唑[8]。肺孢子菌肺炎无首选药物，替代疗法有氨苯砜加甲氧苄啶，克林霉素加伯氨喹，阿托伐喹，戊脒，卡泊芬净等[9]。

临床对抗真菌药物的广泛使用以及在工农业生产中杀菌药物的广泛使用使得对一种或多种抗真菌药物表现出耐药性的真菌种类越来越多，并可能导致治疗无效[10]。目前已出现耐三唑类药物的烟曲霉[10]、热带假丝酵母菌、副丝酵母菌[11]和耐多药金黄色假丝酵母菌[12]，耐多药光滑假丝酵母菌的流行率也不断上升。有报道三唑类抗真菌药物对新型隐球菌性脑膜炎患者治疗无效[13]；真菌性肝脓肿阻止了抗真菌药物向感染部位的有效渗透和分布，促进了耐药真菌的存活和出现[14]。抗真菌药物的耐药性可以是获得性的，即在抗真菌治疗过程中真菌产生了耐药性；也可以是固有性的，如克鲁西假丝酵母，它固有地对氟康唑等唑类药物产生耐药性。

2 真菌的抗真菌药物耐受和耐药机制

真菌对抗真菌药物有耐受和耐药两种反应，前者指真菌没有发生耐药突变，后者指真菌接受外源抗性基因发生了耐药突变，导致真菌感染治疗失败[15]。

2.1真菌的抗真菌药物耐受机制 真菌的耐受途径因使用的抗真菌药物不同而有差异。例如，真菌体内高渗甘油（HOG）、蛋白激酶C（PKC）和钙调神经磷酸酶参与了真菌对棘白菌素药物的耐受，称为细胞壁完整性途径；PKC 和钙调神经磷酸酶还参与了对三唑类药物的耐受，称为膜完整性途径[16]。真菌体内的热休克蛋白90（HSP90）通过稳定PKC 和钙调神经磷酸酶发挥重要作用，与真菌对药物耐受性的产生有重要关系[17]。特异性HSP90 抑制剂与抗真菌药物结合使用，可有效抑制霉菌和念珠菌中的耐药菌株生长[16]。有研究显示，近35%的热带假丝酵母菌血液分离株表现出高度的氟康唑耐受性，其中近1/3 的感染患者使用氟康唑治疗时出现治疗无效[18]。

2.2真菌的抗真菌药物耐药机制

2.2.1念珠菌属的耐药机制 在发展中国家，三唑类药物是治疗侵袭性念珠菌感染的主要药物[19]，对三唑类药物耐药的真菌（尤其是白念珠菌），其外排泵分为两大类：ATP 结合盒转运蛋白（CDR1 和CDR2）和促进因子超家族转运蛋白（MDR1 和MDR2）[19]。它们分别受转录因子Tac1 和Mrr1 的调控[20]。当真菌受到三唑类药物攻击时，真菌反应性地过度表达外排泵[20]。三唑类药物作用靶点ERG11 基因上的CTG 修饰是真菌（白念珠菌、副丝酵母菌、热带念珠菌、金黄色念珠菌）重要的耐药机制[20]。异源表达和比较测序研究已确定，真菌ERG11 基因中Y132F、K143R、G458S 的氨基酸替换，深刻影响着三唑类药物的药敏谱[21]。

2.2.2烟曲霉的耐药机制 烟曲霉对三唑类药物耐药是一种多因素现象，涉及基因Cyp51A 的修饰和过度表达，以及真菌外排泵（主要是CDR1B 和AtrF）的过度表达[22]。烟曲霉基因TR34/L98H 和TR46/Y121F/T289A 突变与对三唑类药物耐药有关[22]。研究表明，实验室产生的对伏立康唑耐药的黄曲霉分离物在Yap1 基因L558T 中携带氨基酸替换，此氨基酸替换导致外排泵AtrF 过度表达[22]。

2.2.3新型隐球菌和肺孢子菌的耐药机制 新型隐球菌对三唑类药物耐药与ERG11 基因突变和（或）ERG11 和ATP 结合盒转运体的过度表达有关。新型隐球菌耐药的出现还与药物暴露有关，当增加抗真菌药物剂量或联合用药时可治疗耐药新型隐球菌感染[23]。在耐三唑类药物的新型隐球菌菌株中，三唑类药物雷夫康唑对编码G344S 替代蛋白的菌株显示出有效性[24]；外排泵抑制剂（FK506，钙调神经磷酸酶抑制剂）与伏立康唑联合使用时最小抑菌浓度（MIC）比单用伏立康唑低4 ～8 倍[24]。新型隐球菌中存在异质耐药亚群，当暴露于抗真菌药物时，可导致耐药变体形成和克隆扩增，从而导致对氟康唑耐药[25]。

3 抗真菌药敏实验（AFST）

AFST 的主要目的是提供MIC 值，以指导最佳抗真菌治疗，并监测对抗真菌药物耐药菌株的出现和提供流行病学报告。在真菌感染治疗方面，可通过正确识别真菌及其固有的药物敏感性特征来选择药物；因此，在潜在的侵袭性感染中，如果怀疑有抗真菌药物耐药性，或者治疗无效时，建议进行AFST[26]；建议实施抗真菌管理计划，该计划包括真菌菌种鉴定和从体内（如血液）采集标本的AFST 监测[26]。AFST 提供MIC 通常需要24 ～48 h，并且技术因素（有氧环境、高糖、浮游细胞、生长介质等）以及真菌因素（菌丝、分生孢子和真菌生物膜的混合物、真菌毒力和适合度等）可能会影响MIC 读数[27]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）属于抗真菌药敏实验，具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，可在几个小时内提供结果。未来需要研究一种简化、自动化的方法来广泛测试真菌和抗真菌药物耐受性。已有一种低成本四孔平板琼脂法适用于曲霉菌种的棘白菌素敏感性筛选[27]。

4 真菌耐药性的检测

在检测真菌耐药性的分子学方法中有一个主要限制：相同的耐药性表型可能由不同位点的突变引起[28]。基于全基因组测序对生物体耐药机制的研究方法，对真菌分离物进行的基因组研究显示，其分类与标准的药物敏感性试验非常一致[29]。微生物耐药、MIC 和靶基因的特异性突变之间存在很强的相关性，曲霉菌对三唑类抗真菌药物的耐药可使用全基因组测序的方法进行评估[30]。分析二代测序技术（NGS）提供的数据，回答特定的临床问题，可使临床医生能够根据数据对病情做出快速反应。理想情况下，临床级NGS 系统应封装为全自动或半自动设备，以最直接、最快速的方式处理样本并输出可参考数据。随着我们对抗真菌耐药性遗传基础的认识不断增长和加深，以及采用新的分子工具进行微生物诊断的研究，预计真菌耐药性的分子检测将成为临床应用的重要组成部分。

5 治疗耐药真菌感染药物的检测及药物剂量优化

多种因素可能影响抗真菌药物的吸收、分布和代谢，包括感染的易感因素以及感染的部位和严重程度，所以侵袭性真菌感染的治疗往往是复杂的，通常需要进行治疗药物监测用于测定抗真菌药物浓度，以防止剂量不足导致真菌耐药和（或）治疗失败及剂量过高可能导致的药物毒性。主要指南建议，一旦侵袭性曲霉菌病的三唑类药物治疗达到效果稳定状态，如果进行延长的预防疗程，应进行治疗药物监测，包括美国传染病学会的治疗药物监测（TDM）和欧洲临床微生物学和传染病学会的治疗药物监测（ESCMID）。使用伏立康唑治疗侵袭性念珠菌病期间进行TDM[30]，使用5-氟胞嘧啶、伏立康唑和泊沙康唑治疗时使用ESCMID[31]。泊沙康唑抗酵母菌的体外实验发现，其浓度- 时间曲线下面积（AUC）和MIC 均与泊沙康唑的药代动力学/药效学（PK/PD）一致[32]。在侵袭性霉菌感染中，泊沙康唑、棘白菌素类药物的AUC/MIC 决定了其治疗效果[32]。峰值浓度（Cmax）和MIC 是两性霉素B 和棘白菌素类药物重要的PK/PD 指标[32]。已经证明，在三唑类耐药真菌感染的治疗中，使用更高剂量的伏立康唑和泊沙康唑治疗有效[32]。

6 治疗耐药真菌的新药物研制

耳道假丝酵母菌是一种多药耐药真菌。在美国，90%的耳道假丝酵母菌菌株对氟康唑具有耐药性，约30% 的耳道假丝酵母菌菌株对两性霉素B 具有耐药性，对棘白菌素类具有耐药性的耳道假丝酵母菌菌株不到5%；而印度耳道假丝酵母菌菌株中约有1/4 对两种或两种以上的抗真菌药物具有耐药性[33]。对于这些高度耐药的念珠菌的治疗，人们急切地期待着ibrexafungerp 的获准使用。ibrexafungerp 是一种新的抗真菌药物，它与棘白菌素类药物一样，通过锚定葡聚糖合酶的结构来攻击真菌细胞壁。伊布昔芬（ERP）目前在临床III 期试验[34]中进行了评估，显示出良好的口服生物利用度，使该药物在长期或动态治疗对三唑类抗真菌药耐药的酵母感染或有三唑类抗真菌药禁忌证的患者中具有潜在的使用价值。Rezafungin 是一种新型棘白菌素类药物，其III 期临床试验即将开始，其半衰期比其他棘白菌素类药物长得多，可每周注射1 次[35]，重要的是，它可以高剂量给药，从而克服某些类型真菌的棘白菌素类药物耐药。与其他棘白菌素类药物相比，Rezafungin 具有更好的抗曲霉菌活性，因此可能成为治疗耐三唑类药物曲霉菌病的替代选择[35]。

因耐三唑类药物烟曲霉的流行病学不同，三唑类药物不被普遍推荐为主要抗真菌药物。脂质体两性霉素B 是治疗三唑类药物耐药曲霉菌病的首选药物[36]。目前正在临床开发的新的抗真菌药物包括fosmanogepix，也称为APX001，是一种口服广谱抗真菌药物；orotomides 以二氢乳清酸脱氢酶为靶点[37]，没有药物间相互作用和毒性负担，对烟曲霉菌具有很高的抗药性[37]。

7 小 结

念珠菌和曲霉菌耐药真菌的增加对人类健康构成了严重威胁，三唑类抗真菌药耐药的出现，需要人类更好地了解真菌潜在的耐药机制。在全球范围内尽量减少耐三唑类烟曲霉分离株的出现，需要在农业和临床上采取严格的抗真菌管理措施。因此，建议应用AFST、TDM 和准确的物种鉴定作为常规抗真菌药物决策的一部分。因抗真菌药物的有限性和耐药真菌的日益增加，需要人类发现新型抗真菌药物。以HSP90、PKC 和钙调神经磷酸酶抑制剂为靶点的辅助药物可限制真菌产生药物耐受，应鼓励其发展。