TRPV4和TGF-β1在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

祖木热提古丽·阿不来提 陈镭雨 马琰迪 何尚峰 热孜亚古丽·阿克木 徐江

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，2018 年全球新增354 864 例恶性肿瘤病例，就有177 384 例死于口腔癌[1-2]。我国口腔颌面部的恶性肿瘤以鳞状细胞癌最普遍，达到了80%。瞬时受体电位通路(Transient receptor potiential,TRP)超家族是一类大的非选择性阳离子通道亚基，广泛的分布在各种低高等生物中，参与多种细胞的功能调节，与多种癌症有关[3]。其中，瞬时感受器电位香草酸受体亚型4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是非选择性的阳离子通路，Ca、Na等阳离子的发卡状通路，参与多种细胞功能[4]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是一个生物多效性的生长分化机制，在许多癌症中异常高表达，而且也与癌症的生物学行为密切相关。本实验将采用免疫组织化学Envision法，测定在OSCC和癌旁正常组织中TRPV4、TGF-β1的表达情况，并探讨TRPV4、TGF-β1表达与OSCC临床特性和术后生存率之间的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本和资料收集

本实验纳入OSCC样本103 例，同时选取癌旁正常组织66例(距离癌组织2 cm以上)，样本来自于石河子大学医学院第一附属医院2004 年～2019 年间病理确诊的病例石蜡组织。同时收录了103 例蜡块相对应的患者临床病历资料，包括姓名、性别、年龄、病理诊断、分化程度、T分期、N分期、TNM分期、确诊日期、总生存时间等，并建立组织样本信息库。通过电话、医院病历或其他方法等103 例OSCC中随访例数为74 例。

1.2 主要试剂

兔抗TGF-β1多克隆抗体(Affinity公司，AF1027,美国)；稀释浓度1∶200；TRPV4兔多克隆抗体(Abcam公司，ab94868，英国)；稀释浓度1∶150；免疫组化试剂盒(北京市中杉金桥生物科技股份有限公司)。

1.3 实验方法及结果判定

采用免疫组化EnVision二步法(ELPS)检测TRPV4和TGF-β1的表达水平。实验结果由两名病理医生随机双盲阅片和评分。采用判定准则：以综合染色强度与阳性细胞总量比例作为评价。积分数=阳性染色细胞百分比评分×染色强度评分。百分比判定标准：0%～5%(0 分)、6%～25%(1 分)、26%～50%(2 分)、51%～75%(3 分)、76%～100%(4 分)。染色强度评分：无色(0 分)，淡黄色(1 分)，黄色(2 分)，棕黄色(3 分)，棕褐色(4 分)。阳性等级：0～4为阴性(-)，5～8为弱阳性(+)，9～12为阳性(++)。以(+～++)为阳性，(-)为阴性。

1.4 统计学方法

使用SPSS 23.0软件进行统计分析，OSCC组织中TRPV4和TGF-β1的表达水平和临床病理特征间的相关性用χ2检验进行比较。 ROC曲线和AUC用于评估TRPV4和TGF-β1表达对于预测口腔鳞状细胞癌的特异性和灵敏度。使用Kaplan-Meier方法对患者随访的生存情况进行分析。P<0.05为差异有统计学含义。做图时均使用了Graphpad 5.0软件。

2 结 果

2.1 TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常组织中的表达

TRPV4和TGF-β1在OSCC及癌旁正常组织中的表阳性率分别为69.90%、74.76%和24.24%、19.70%，差异有统计学意义(P<0.05，表 1，图 1)。TRPV4、TGF-β1在OSCC及癌旁正常组织评分等级间的差异具有统计学意义(P<0.05，表 2，图 2)。

表 1 OSCC及癌旁正常组织中TRPV4和TGF-β1的表达

表 2 OSCC及癌旁正常组织中TRPV4和TGF-β1的表达差异

图 1 TRPV4和TGF-β1在不同组织中的表达(ELPS)

图 2 TRPV4和TGF-β1在不同组织中的表达

2.2 TRPV4,TGF-β1在OSCC组织中的表达与临床病理因素之间的关联

TRPV4的表达与TNM分期，分化程度密切相关(P<0.05)，与年龄、性别、浸润深浅、淋巴结转移无相关性(P>0.05)；TGF-β1的表达与浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)(表 3)。

表 3 TRPV4,TGF-β1表达与OSCC临床病理因素之间的关联

2.3 TRPV4,TGF-β1在OSCC组织中表达的相关性

经Spearman等级的相关分析，TRPV4与TGF-β1的表达，在103例OSCC组织中均呈正相关(r=0.211、P=0.033)(表 4)。

表 4 TRPV4和TGF-β1在口腔鳞状细胞癌中表达的相关性

2.4 TRPV4,TGF-β1表达与OSCC的ROC曲线分析

本实验使用ROC曲线分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及对照组中免疫组化评分的诊断价值。结果显示TRPV4,TGF-β1表达在OSCC的表达曲线下AUC值为(0.842，0.857)(图 3)，用诊断临界值确定OSCC的灵敏度和特异性。(诊断临界点为5)。

图 3 ROC分析TRPV4,TGF-β1在OSCC及对照组中免疫组化评分 图 4 TRPV4,TGF-β1表达与OSCC患者预后的生存分析

2.5 TRPV4,TGF-β1表达与患者预后的关系

103 例OSCC中，74 例患者获得临床随访信息。Kaplan-Meier生存曲线比较OSCC中TRPV4,TGF-β1表达和患者预后的关系，结果如图 4，高表达TRPV4,TGF-β1的OSCC患者生存时间显著少于低表达患者(P=0.019 3、P<0.000 1)。

3 讨 论

口腔鳞状细胞是人类头颈部常见的恶性肿瘤，发病率位于各种癌症的第九位，并且近年来呈逐渐上升趋势[5]。与其他肿瘤相似，OSCC的发生发展是受多因素共同参与的过程，如环境、饮食、遗传等。近年来OSCC的预防、早期诊断和治疗预后，已成为全球备受重视的公共卫生问题。

TRP通道是Pak等[6]在1969 年在突变性果蝇眼底视网膜光感受器上首次被发现。TRP超家族跟其他种类的研究一样展现在的面前[7]。其中TRPV是较大、最多样化的重要亚基[8]。有研究证实TRPV亚家族成员TRPV4参与调节多种癌症的发病、发展，其功能并不一致。Yamada等[9]研究表明，TRPV4在实验小鼠的膀胱尿路上皮基地细胞中高表达，4-aPDD激活TRPV4促进肿瘤的形成。与这些研究的结果恰恰相反，Adapala等[10]表明TRPV4在肺肿瘤起源的内皮细胞(TECs)中的表达明显低于正常内皮细胞(ECs)促进血管形成与成熟，抑制肿瘤的生长。TRPV4在其他肿瘤领域已经广泛研究，然而有关TRPV4在OSCC的表达情况报道却鲜少。本研究结果显示，TRPV4在OSCC中呈高表达，且表达明显高于癌旁正常组织，结果与Fujii等[11]在OSCC中TRPV4高表达的研究结果一致，表明TRPV4表达很可能与OSCC的发生和进展相关。本研究还显示TRPV4的表达水平和肿瘤的分化程度，以及与TNM分期相关(P<0.05)，高中分化OSCC组织中TRPV4的表达程度比低分化OSCC组织低，表明TRPV4可能参与了OSCC的恶变过程。

TGF-β1是TGF-β多功能多肽家族成员之一[12]，在多种肿瘤组织中表达异常，与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。在本研究中发现OSCC组织中TGF-β1的表达明显高于癌旁正常组织中(P<0.05)，结果与孙乐刚等[13]研究结果一致。宋阳等的研究表明[14]，TGF-β1诱导活化HSC-T6细胞，结果活化的HSC中TRPV4表达明显升高。本研究经Spearman等级的相关分析，结果显示TRPV4和TGF-β1在OSCC中的表达则呈正相关，提示二者可能对OSCC的发生、发展具有协同促进作用。本实验通过ROC曲线分析，表明TRPV4和TGF-β1有较高诊断效能，并用ROC曲线确定了诊断临界值，为今后诊断OSCC提供一种新的生物学检测方法。在本研究中作者对纳入患者进行随访，应用Kaplan-Meier法对患者生存分析，结果显示TRPV4和TGF-β1高表达组患者的术后生存时间明显低于低表达组，证明了TRPV4和TGF-β1与OSCC的患者生存率密切相关。

综上所述，TRPV4和TGF-β1在OSCC中表达显著升高，且TRPV4和TGF-β1高表达提示OSCC患者预后差，可能是诊断和预后判断的潜在生物标志物。但是TRPV4和TGF-β1在OSCC中的作用机制及内在关系还需进一步深入研究。