NLRP3炎症小体与心肌缺血再灌注损伤的研究进展

张 熙，黄 兵，王贵鹏

1新疆医科大学，乌鲁木齐 830000 2武汉大学，武汉 430000 3新疆医科大学第五附属医院心内科，乌鲁木齐 830000

《中国心血管病报告2018》显示，中国居民最主要的死亡原因为心血管疾病，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)起病急、病情变化快、致死率高，已成为威胁中老年人群生命健康的主要疾病之一[1]。及时开通阻塞的冠状动脉血管、尽早给予抗凝/抗血小板药物是AMI治疗的关键，对降低患者死亡率至关重要。伴随冠状动脉血流恢复的同时，心脏功能和结构可能再次出现损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[2]，其发生机制主要包括炎症反应、氧自由基增多、Ca2+超载、pH快速恢复及线粒体通透性转换孔开放等。目前MIRI的治疗仍未取得令人满意的疗效，亟需探寻新的治疗靶点。近年，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleo-tide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体因确切的促炎作用而被广泛研究，其在MIRI发生发展中的作用逐渐获得临床关注。本文将围绕NLRP3炎症小体的形成与功能及其与MIRI关系的研究进展进行综述。

1 NLRP3炎症小体的概念

NLRP3炎症小体是多蛋白质复合物，在内外源性因素刺激下(如细菌、游离脂肪酸、强紫外线等)，其通过损伤相关分子模式或病原体相关分子模式感知细胞外危险信号，并促进半胱天冬酶1(caspase- 1)、诱导白细胞介素(interleukin, IL)- 1β、IL- 18等炎症因子成熟和释放，启动天然防御和炎症反应[3]，同时诱导细胞焦亡[4]。NLRP3炎症小体主要包括三部分[5]：第一部分为受体蛋白,即NLRP3，其C-端和N-端结构通过结合寡聚化结构域的核苷酸(nucleoside triphosphatase domain, NACTH/NOD)衔接，该结构前段拥有大量的亮氨酸重复序列(leucine rich repeat domain, LRR)，能感知内外威胁，中间区域通过介导蛋白寡聚化，参与炎症小体的形成，末段包含两个功能域即热蛋白结构域(pyrin domain, PYD)和胱天蛋白酶募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)，参与信号分子传导;第二部分为凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a card domain, ASC)，包含C-端的CARD和N-端的PYD，其主要介导衔接功能，是炎症小体的接头蛋白;第三部分为前体半胱天冬酶- 1(procaspase- 1)，包含CARD、P20和P10结构域，是炎症小体的效应蛋白。

2 NLRP3炎症小体的形成与功能

NLRP3炎症小体的形成包括激活、组装与调节，介导炎症介质释放，诱导细胞焦亡等步骤，在整个过程中NLRP3为“感受器”，ASC为“神经纤维”，procaspase- 1为“效应器”。首先，LRR识别各种内外源性危险信号后，通过不同的信号通路激活次级防御机制，引起NOD构象变化并发生寡聚化；在同型蛋白相互作用下，ASC的N端与NLRP3的PYD相连，C端与procaspase- 1的CARD相连，在NLRP3初始寡聚的环状构象上聚合形成结构稳定且复杂的细丝[6]，完成炎症小体装配。之后procaspase- 1二聚体发生自我剪切，产生4个亚基(2个CARD亚基，1个P20亚基，1个P10亚基)并聚合为四聚体，形成caspase- 1[7]。大量caspase- 1的细丝以聚合的ASC为核心从中分支，形成更利于接触基质的星状结构，同时激活的caspase- 1可裂解前体IL- 1β、IL- 18为活化的IL- 1β、IL- 18，从而发挥免疫应答和级联放大的炎症反应[8]。caspase- 1还可裂解为参与Krebs循环的几种蛋白，使细胞能量产生急剧减少，导致细胞水肿[9]。此外，caspase- 1在细胞焦亡中亦发挥着至关重要的作用，其裂解消皮素D形成N端和C端片段寡聚物后，与膜磷脂结合并诱导细胞膜孔(直径约10～20 nm)形成[10]，导致质膜溶解，多种大分子和促炎介质由此向细胞外释放。在NLRP3炎症小体调控过程中涉及多个信号通路，如TlR4/MyD88/NF-κB通路、RISK/线粒体通路、miR- 346- 3p/CaMKIId通路，以发挥不同的生物学效应。

3 NLRP3炎症小体与MIRI

3.1 NLRP3炎症小体促进心肌细胞焦亡

在MIRI过程中，保留正常功能的心肌细胞数量直接影响心脏功能和远期临床预后，除再灌注后冠状动脉无复流会导致心肌细胞死亡外[11]，NLRP3炎症小体介导的心肌细胞焦亡也直接影响心脏收缩能力。相对细胞凋亡，细胞焦亡不发生染色体裂解、核碎裂和核固缩，是另一种形式的细胞死亡，其参与多种疾病的发生发展，尤其与缺血再灌注后的心肌组织损伤有关[12]。研究显示，抑制NLRP3炎症小体信号通路可减少心肌细胞焦亡，缩小心肌梗死面积，保护心功能[13]。在体外培养的心肌细胞再灌注实验中，腺苷酸环化酶活性降低，细胞内cAMP水平较低，产生的大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)一方面可直接损伤心肌，另一方面通过活化NLRP3炎症小体而诱导细胞焦亡，促进MIRI发生[14]。

3.2 NLRP3炎症小体的级联放大促炎作用

NLRP3炎症小体在心肌再灌注期间具有级联放大的促炎作用。再灌注期间，随着血液和氧的回流，心脏产生强烈的应激反应，由于过度的保护和防御机制，激活的免疫系统和无菌性炎症反应会导致严重的心肌损伤[15]。类似于病原体介导的有菌性炎症，NLRP3炎症小体介导的无菌性炎症贯穿于MIRI整个过程，其引起大量炎症介质释放至细胞外，在黏附分子的作用下，过量白细胞聚集并紧密黏附于狭窄的毛细血管，各种促炎刺激信号引起中性粒细胞、巨噬细胞和其他类型白细胞持续向炎症部位募集[16]，加重MIRI。另一方面，大量三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)被释放后可刺激嘌呤能受体(P2X7)介导的炎症小体形成以及IL- 1β、IL- 18等促炎介质产生，并激活周围的成纤维细胞、心肌细胞，进一步加剧炎症反应、加重心肌损伤、加速心脏纤维化[17]。

3.3 NLRP3炎症小体破坏心肌血管内皮细胞

除在内皮细胞和成纤维细胞中高表达外，NLRP3炎症小体在心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)中也有明确表达，CMECs是心脏非心肌细胞的重要组成成分之一，广泛参与和调节炎症进程，而NLRP3炎症小体不仅参与各种因素引起的细胞损伤，亦具有调节内皮前体细胞功能的作用[18]。在血管内皮和平滑肌层中表达的P2X7是非特异性阳离子通道，具有激活NLRP3炎症小体的效应，可致血管内皮功能障碍[19]，进一步加重MIRI。动物实验中，给予转基因小鼠过表达Beclin- 1后，小鼠心脏炎症细胞CD68和CDB220表达减少[20]，在另一项MIRI小鼠模型中证实，miR- 495可通过抑制NLRP3炎症小体信号通路改善CMECs损伤[21]，侧面验证了NLRP3炎症小体可破坏微血管内皮屏障。因此，阻遏NLRP3炎症小体的激活，或可减轻微血管内皮损伤，减少再灌注后心肌组织坏死。

4 NLRP3炎症小体的靶向治疗

4.1 NLRP3炎症小体自身

4.1.1 NLRP3抑制剂

研究证实NLRP3抑制剂小分子mcc950可选择性抑制NLRP3与ASC的结合且不依赖ATP酶活性，显示出减轻MIRI的潜力[22]。但在急性类风湿关节炎Ⅱ期临床试验中，mcc950被发现具有肝毒性从而限制了其临床应用。最近的基础研究中[23]，对缺血心肌使用NLRP3选择性抑制剂INF预处理后，发现NLRP3炎症小体形成显著减少，炎症反应显著减弱，可能与RISK通路激活及氧化还原防御上调有关；与此同时，该项研究使用抗血小板药物替格瑞洛预处理也得到了一致的结论，但在离体心脏研究中却得到了不同的结果，认为替格瑞洛的直接靶点并非心肌，而是通过抗血小板作用调节而实现。目前NLRP3选择性抑制剂对MIRI的研究尚处于动物实验阶段，可为后期临床研究提供新的思路。

4.1.2 秋水仙碱

秋水仙碱的抗炎作用很大程度上与其抑制NLRP3炎症小体相关炎症因子表达有关。作为NLRP3炎症小体的非特异性抑制剂[24]，秋水仙碱传统用于治疗痛风。近期多个大型临床试验均肯定了秋水仙碱对冠状动脉粥样硬化事件的二级预防作用[25- 26]。动物实验进一步明确了其作用机制，对MIRI小鼠模型进行短期秋水仙碱预处理后，NLRP3炎症小体和lL- 18的表达均得到抑制[27]。秋水仙碱可在两个方面下调NLRP3炎症小体的活性：一方面抑制P2X7受体的激活，另一方面阻碍ASC的聚合[28]。由于秋水仙碱毒性较强，严重肾病或肝病患者应谨慎使用。

4.1.3 caspase- 1

研究发现，再灌注前给予选择性caspase- 1抑制剂VX- 765，可通过抑制IL- 1β/p38MAPK通路上调CX43表达、降低心肌组织IL- 1β水平，减轻MIRI[29]。此外，在缺血或再灌注前应用caspase- 1抑制剂可增强其对P2Y12拮抗剂的保护作用[30]，通过激活RISK通路减小大鼠心肌梗死面积[31]。但目前的研究结果均来源于动物实验或体外实验，尚需相关临床研究加以证实。

4.1.4 IL- 1β

Koumine是秀丽隐杆菌的主要成分之一，常用于治疗类风湿关节炎等炎症疾病。临床前研究显示，NLRP3炎症小体激活后，应用Koumine可有效减轻中性粒细胞浸润，依赖性抑制巨噬细胞分泌IL- 1β，减轻炎症损伤[32]，还可阻断ASC形成，阻碍NLRP3-ASC相互作用，此种抑制作用归因于其通过ROS/NF-κB/NLRP3信号轴影响NLRP3炎症小体激活。Nazir等[33]研究显示，心肌再灌注前后进行凝血蛋白酶活化蛋白C处理，可通过mTORC1抑制与MIRI相关细胞中IL- 1β的成熟和释放，抑制NLRP3激活和caspase- 1表达，从而减轻缺血再灌注损伤，但仍缺乏临床试验验证。

4.2 NLRP3炎症小体调节因子

4.2.1 ROS

丙酮酸乙酯是一种抗氧化剂，可调控ROS相关NLRP3炎症小体活性，对缺血再灌注损伤的心肌具有保护作用[34]。红花黄素是一种黄酮类化合物[35]，具有活血化瘀、止痛等多种药理作用，其可通过减少ROS释放和下调炎症反应保护心肌免受MIRI。利拉鲁肽预处理可调节SIRT1/NOX4/ROS通路活性，抑制缺氧诱导的细胞焦亡[36]，从而减轻MIRI。目前，ROS相关药物靶点的研究仍较少，且缺乏系统研究。

4.2.2 线粒体

线粒体自噬可促进caspase- 1激活和IL- 1β分泌，线粒体裂变/融合可调节线粒体稳态、激活NLRP3炎症小体[37]。心脂素是一种线粒体脂质，可与NLRP3炎症小体结合，并促进炎症小体活化[38]，抑制心磷脂产生可减弱NLRP3炎症小体活性，为以线粒体为靶点减轻或预防NLRP3炎症小体相关MIRI提供了可能性。

4.2.3 信号通路

黄芪苷具有抑制NF-κB信号通路的作用，通过调节Keap1/Nrf2轴抑制氧化应激和NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡[39]。胡椒碱可下调miR- 383/RP105/Akt信号通路活性，减弱MIRI和心肌细胞焦亡[40]。损伤标志物miR- 330- 5p已被证实参与脑损伤和肾脏缺血再灌注损伤，其在心肌中亦呈特异性表达。动物实验表明[41]，抑制miR- 330- 5p表达可显著增加caspase- 1、IL- 1β、IL- 18和TNF-α等NLRP3 炎症小体相关蛋白表达水平，导致心肌梗死体积增加，加剧心功能障碍程度；T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白- 3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule- 3, TIM- 3)被确认为是miR- 330- 5p的潜在靶点，通过小干扰RNA抑制TIM- 3表达可达到减轻MIRI的目的，提示miR- 330- 5p/TIM-3轴参与了NLRP3炎症小体介导的心肌炎症的调节。

4.3 中医药

毛冬青在中医领域内被广泛用于治疗心血管疾病[42]，其活性成分PBA可抑制巨噬细胞和心肌细胞中NLRP3炎症小体活性，减小心肌梗死面积[43]。枫香是一种具有抗炎作用的传统中草药，在感染性疾病和炎症性疾病中作为抗氧化剂和抗炎剂被广泛应用，研究发现其可减轻MIRI的严重程度[44]。此外，人参皂苷和黄芩苷等中药活性成分通过抗氧化和抗炎作用亦对MIRI具有保护作用。这些中医药在我国应用广泛，具有临床推广意义，为中医防治MIRI提供了理论依据。

5 小结

NLRP3炎症小体存在于多种心血管疾病的缺血组织，其介导的无菌性炎症贯穿于MIRI整个过程，通过多种炎症因子和信号通路，参与MIRI的发生发展。通过抑制其组成成分及信号通路可改善MIRI，为临床防治MIRI提供了新的思路。但目前诸多研究成果仅在动物模型中取得，尚缺乏相应的临床证据。未来仍需开展更多的动物研究和临床试验，探究更多针对NLRP3炎症小体的药物靶点，并促进其临床转化，以预防和减轻MIRI，改善AMI患者临床预后。

作者贡献：张熙负责查阅文献、撰写论文；黄兵负责形成论文框架、修订论文；王贵鹏负责对论文进行审校。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突