基于tau蛋白的阿尔茨海默病药物研发方法概述

仲苏月，谭秋龙，姚炫豹，杨佳颖，肖时锋

(深圳大学生命与海洋科学学院,广东 深圳 518060)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以进行性认知损伤为主要临床表现的神经退行性疾病，发病比例随着年龄的增长而增加。2018年全球AD患者大约有4 800万人，随着全球老龄化程度加重，患病人数将会不断增加。AD患者的记忆力减退、主观认知能力下降，导致其正常生活受到严重困扰。AD已成为一种常见的老年人死亡病因[1]。90%以上AD为散发性病例，其发病机制复杂多变，以β淀粉样蛋白(amyloid-β protein，Aβ)级联假说和tau蛋白假说为主。近年来，以Aβ或淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)剪切酶为靶点的药物在临床试验中效果均不理想，促使更多研究者将目光转向tau蛋白在AD发病中的作用和分子机制[2]。与Aβ相比，tau蛋白的聚集水平与认知功能障碍之间具有更为密切的正相关性[3]。目前，进入临床研究的tau病理靶向药物大多通过免疫疗法促进tau蛋白清除。AADvac1是第一个进入临床的tau蛋白疫苗，2021年6月，AADvac1在Ⅱ期临床试验中达到主要终点和关键次要终点[4]。由AC Immune公司开发的抗p-tau疫苗ACI-35.030目前正在Ⅱ期临床试验中。除了免疫疗法之外，LMTM是一种基于抑制tau蛋白聚集开发的药物，目前Ⅲ期临床试验正在进行[5]。本综述总结了基于tau蛋白的药物研究所常用的方法和模型，以供科研工作者参考。

1 Tau蛋白

Tau蛋白是一种在神经系统广泛表达的微管结合蛋白，其编码基因位于人类17号染色体上，经选择性剪接后，在人脑内可以产生6种异构体。生理状态下，tau蛋白与微管结合，协助微管组装并稳定微管，对神经元细胞骨架的维持、细胞内物质运输及信号转导具有重要作用[6]。病理状态下，tau蛋白在胞内异常聚集形成双螺旋丝，并进一步折叠形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。1986年，Grundke-lqbal等[7-8]发现AD患者NFTs中的主要成分是tau蛋白，并于同年发现AD患者脑中的tau蛋白呈现高度磷酸化状态。目前对tau聚集较为合理的解释是，tau蛋白上的异常翻译后修饰(主要是过度磷酸化)导致其与微管的结合能力减弱，tau从微管上脱落，从而聚集形成寡聚体，并进一步形成原纤维丝，最终形成NFTs。此过程中产生的tau蛋白寡聚体被认为是最具神经毒性的形式，并且其能够在神经元之间或脑区之间传播，诱导神经元内正常的tau蛋白病变[9]。因此抑制tau蛋白过度磷酸化、阻断tau蛋白聚集、稳定微管、清除tau寡聚体等成为针对tau病理靶向药物研发的主要策略[10]。

2 常用研究模型及评价方法

2.1 体外分子水平研究方法 体外分子研究主要利用肝素、磷脂酰等试剂，在体外将人工合成的tau蛋白(全长型、突变型、截短型等)诱导形成寡聚体或纤维，其主要优势是可以快速、高通量地筛选有可能抑制tau蛋白聚集或过度磷酸化的小分子或化合物。Tau蛋白的聚集与其蛋白序列中两段易于聚集的六肽片段具有高度相关性，分别是位于微管结合区第二和第三重复序列的275VQIINK280(PHF6*)和306VQIVYK311(PHF6)[11]。PHF6在高度有序的反平行β片层结构中形成立体拉链，有很强的自聚集倾向，在体外形成类似全长tau的纤维丝。因此PHF6片段作为一种体外模型被广泛地用于高通量筛选tau蛋白聚集抑制剂的候选药物[12-14]。除了全长tau蛋白和这两种六肽段，含PHF6*的第二重复序列(R2)、含PHF6的第三重复序列(R3)、包含4个重复序列的K18片段以及由第一、三、四重复序列组成的K19片段也是体外研究的常用模型[15-16]。上述tau蛋白的截短片段在一定条件下确实可以帮助研究者更快地进行相关药物研究，但是利用截短片段得到的结果未必能真实地反映人体内存在的tau蛋白聚集特性。而且以不同类型的截短片段进行实验可能得到相反的实验结果，2008年发表在Science期刊的一项关于tau蛋白与马达蛋白研究中，较短的tau23与较长的tau40表现出了截然相反的结果[17]。

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Tau蛋白的微管结合域富含带正电荷的赖氨酸残基，在生理条件下具有高溶解度。故而在体外实验中通常采用阴离子辅助剂诱导其聚集。用于诱导tau蛋白体外聚集的诱导剂主要可以分为聚阴离子(如肝素)和脂肪酸(如花生四烯酸)两大类。1996年，Goedert等[18]发现未过度磷酸化的tau蛋白在体外与硫酸化的糖胺聚糖一起孵育时，会形成成对的螺旋状细丝。1997年，Wilson等[19]发现游离脂肪酸在体外可以诱导tau蛋白和Aβ聚集。此后，肝素和花生四烯酸诱导的聚集模型被广泛应用于tau蛋白的体外聚集研究。在没有诱导剂的情况下，tau蛋白在体外的聚合能量屏障极高，诱导剂有效地降低了这种能量屏障。需要引起注意的是，大多数tau蛋白或其截短片段聚集的体外诱导只模拟了聚集的终点事件，而缺少对聚集动力学过程的模拟。在生理状况下，tau蛋白的聚集存在一个起始的“成核”过程。Van Ameijde等[20]对以往的体外tau聚集模型进行了优化，他们在全长tau蛋白中引入了C291A和C322A突变，并且对tau和肝素的比例进行优化，在他们的体外诱导tau聚集实验中，成功模拟了蛋白聚集的成核阶段，并随后验证了抗体对tau聚合早期阶段的干扰作用。但是最近的研究显示，使用肝素诱导的tau细丝与AD患者脑中的细丝在结构上存在很大的差异[21]。Zhang等[22]通过冷冻电镜和免疫电镜观察也得出了类似的结论。因此，在tau蛋白聚集抑制剂的体外筛选中，研究者在解释试验结果时应当将上述差异充分考虑在内。尽管如此，用肝素等聚阴离子或花生四烯酸诱导仍是目前常用的诱导tau蛋白体外聚集的方法之一[23]。

随着近年来诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技术的发展，利用其构建疾病细胞模型来也被广泛地用于人类疾病研究和药物筛选。传统的2D细胞培养由于间质区室的缺乏，难以概括神经组织的复杂性，3D细胞培养技术在一定程度上弥补了2D细胞培养这方面的缺陷。2014年，Choi等[30]首次用3D细胞培养技术在人神经干细胞中同时重现了Aβ病理和tau病理。2018年，Gonzalez等[31]采用额颞叶痴呆患者来源的iPSC诱导出类脑器官，观察到了Aβ和tau蛋白聚集，以及与病理蛋白聚集程度成正比的细胞凋亡现象。同年Yan等[32]使用患者来源的iPSC构建了3D类皮层组织模型，发现了Aβ分泌增多、tau蛋白过度磷酸化以及神经细胞死亡等典型的AD病理特征。这些细胞模型均有望后续能够用于AD的药物设计和筛选。

2.2 细胞水平研究方法 细胞水平研究主要采用以已建立的细胞系或者原代神经元、胶质细胞等为研究对象，在机制研究及药物筛选中是不可或缺的重要组成部分。常用于构建tau病理细胞模型的细胞系有人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、小鼠脑神经瘤细胞Neuro-2a(N2a)、大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC-12、人胚胎肾细胞293(human embryonic kidney cell 293,HEK293)、人髓核细胞(human nucleus pulposus cell,hNPC)和小鼠或大鼠的原代海马神经元等[24]。主要技术方法是通过稳定转染tau、瞬时转染tau或采用诱导剂处理，从而在一定程度上模拟AD患者脑内tau蛋白的聚集状态，进而用于研究药物对于抑制tau聚集的相关效果。如在稳定表达tau441的HEK293细胞中观察到了tau聚集体，用漆黄素处理后这些胞内的聚集体消失[25]。诱导细胞tau病理常用的诱导剂有刚果红、多西环素、冈田酸、甲醛和外源性淀粉样蛋白原纤维等[26]。检测方法主要是硫黄素S染色、针对磷酸化tau蛋白进行免疫染色、引入荧光蛋白和免疫组织化学等方法。此外，本课题组用体外制备的具有细胞毒性的tau寡聚体处理N2a细胞，诱发细胞凋亡，同时发现了两种黄酮类化合物能够保护该tau寡聚体诱导的细胞凋亡[15，27]。最近人们通过荧光漂白恢复技术和超高分辨显微镜观察到神经细胞内的tau蛋白液分离现象[28-29]，这为以tau寡聚体为靶点的药物开发提供了一种全新的研究模型和方法。

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在包括AD在内的tau相关疾病研究中，tau转基因鼠是引用最为广泛的动物模型[34]。1998年，Hutton等[35]对FTDP-17家族中的tau基因进行了测序，确定了患者携带的几个错义突变，其中一个是301位的脯氨酸突变为亮氨酸。2000年，Lewis等[36]创建了表达突变型tau-P301L蛋白的转基因小鼠模型。在该模型中，随着年龄的增长小鼠脑内NFT增多，并且观察到胶质细胞的增生、营养不良性轴突、神经元萎缩等现象，较好地模拟了NFT的病理特征。PS19模型是另一种表达tau-P301S突变的转基因模型鼠，其内源性tau蛋白的表达水平约为正常小鼠的5倍，大约6个月后出现认知、学习、记忆缺陷以及tau病理特征。因为脊髓中的转基因表达而导致后肢麻痹，该品系小鼠大多10至12月龄死亡[37]。rTg4510是一种双基因品系小鼠，携带由CaMK Ⅱ启动子控制的tau-P301L突变，其脑内tau蛋白表达水平高达正常小鼠的13倍，在2～3月龄即出现磷酸化tau蛋白，在4月龄时可在在皮层检测出NFT，6月龄时在海马检测到NFT[38]。然而该品系小鼠的扩大繁殖较为烦琐，其饲养繁殖成本较高。在AD研究中，2003年Oddo等[39]研发的3×Tg-AD小鼠的应用更为广泛，通过将APPswe和tau-P301L显微注射进Psen1-M146V突变基因敲入小鼠的单细胞胚胎中所得到的携带3种基因共存的稳定遗传小鼠，该品系小鼠可同时表现出tau异常聚集和β淀粉样蛋白沉积这两种典型病理特征。

在全部AD患者中，遗传型AD患者只占不到5%，大部分的AD患者是散发型的。因此转基因小鼠模型对散发型AD患者来说可能缺乏一定代表性。对于非转基因AD小鼠模型，目前已有相关报道。冈田酸(okadaic acid，OA)是一种磷酸酯酶2A和磷酸酯酶Ⅰ的抑制剂，可以诱导神经元内tau蛋白过度磷酸化以及细胞凋亡[40]。Baker等[41]通过单脑侧室注射OA后发现在双侧的皮层和海马区均出现tau过度磷酸化以及tau聚集物。该模型多用于与tau蛋白磷酸化相关的药物研发。另外，通过注射AD患者样本分离提取出的tau寡聚体至野生型小鼠脑内，数月后发现注射区域以及邻近区域出现丰富的tau蛋白纤维，同时其认知相关行为表现叶出现明显损伤[42]。近年，Clavaguera等[43]将表达tau-P301S的小鼠脑tau寡聚体提取物注射到未出现认知损伤的人源tau小鼠的脑中，也可诱导小鼠内源tau蛋白自聚集形成纤维细丝，并且tau的聚集物从注射部位扩散到邻近部位脑区。尽管这些模型都可用于tau蛋白聚集和传播的药物筛选，但是由于来源稀缺、过程复杂、不够稳定等因素，难以实现大规模的应用。在尽量模拟AD病人脑内真实情况的基础上，性状稳定可控、易获取的tau蛋白靶向药物研究模型仍需进一步探索研发。

2.3 整体动物水平研究方法 研究人类疾病的动物疾病模型最早出现在1800年，并在随后的时间里不断改良和发展，推动了许多疾病的病理研究和药物开发的进程。合适的动物模型对于药物研发至关重要[33]。

关于tau蛋白的CADD方向主要集中在抑制tau蛋白过度磷酸化、聚集及乙酰化等[45]。Pradeepkiran等[46]以tau蛋白作为靶蛋白，通过分子对接和三维药效团在数据库中筛选出5个针对于tau蛋白过度磷酸化中丝氨酸蛋白激酶的潜在抑制分子，并采用相应的算法对筛选出的5个分子进行了代谢性能和药物毒性的预测。Zeb等[47]设计了细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase 5，cdk25)/p25抑制剂的基本化学结构特点的药效团模型，进而用该药效团模型和分子对接筛选天然产物类药物数据库得到一系列候选药物分子，最后通过分子动力学模拟确定了两种通过占据该激酶中ATP结合部位而靶向cdk5/p25的潜在药物分子。Kiss等[48]以全长tau蛋白和K18片段的单体结构为基础，通过分子对接技术发现了一系列能够与tau蛋白结合从而影响蛋白自身聚集的小分子化合物。有报道发现组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase 6，HDAC6)在AD病理模型中上调[49]，而一种HDAC6抑制剂能够显著降低AD细胞模型内的tau磷酸化程度以及改善AD小鼠模型的记忆、学习障碍[50]。Zeb等[51]基于HDAC6的结构，通过药效团模型和分子对接从一个含841分子的化合物库中筛选出11个能够稳定对接HDAC6的化合物，进一步用分子动力学模拟手段发现3种最具潜力的HDAC6抑制剂，具有一定的AD治疗潜力。随着人工智能技术的飞跃发展，CADD也将更加广泛地应用在AD的药物研发领域，为攻克AD药物研发提供有力的辅助和支撑作用。

2.4 计算机辅助药物开发随着计算机软件和硬件的快速发展，计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)被广泛应用在各类疾病的药物筛选中，提高了药物开发的速度和准确性。CADD常用的技术模块主要包括同源模建、分子对接、药效团模型、定量构效关系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)等。与传统的高通量筛选相比，CADD通过更具针对性的搜索来提高先导化合物的命中率，已经被广泛应用于许多疾病的药物筛选中。通过CADD，药物研发工作者将大型化合物库过滤为范围较小的活性化合物集，大大减少实验工作量。此外，CADD可以指导优化先导化合物，增加其亲和力、增强药效或降低不良反应[44]。对于像AD这种发病机制复杂的疾病，单靶点药物的药效可能十分具有局限性，CADD可以帮助研究人员筛选或设计多靶点药物分子。

3 小结与展望

随着我国人口老龄化程度日益严重，AD逐渐成为危害老年人生活质量和生存寿命的主要危险因素，是我国公共卫生和老年医学领域面临的严峻挑战之一。尽早开发出可用于预防或治疗AD的有效临床药物已成为一项迫切需求。自2003年美金刚上市后，长达十几年没有针对AD的药物获批。2019年耿美玉团队开发了中国原创首款多靶点治疗AD的药物——GV971[52]，并正式在中国有条件上市，但是其临床有效性有待更全面的临床数据支持。2021年6月，靶向Aβ的单抗药物Aducanumab获FDA加速批准上市。该药物由Biogen和Eisai合作开发，由于截至目前临床获益数据不是十分明确，存在很大争议，其临床有效性同样需要更全面的临床数据进一步支持。

早期靶向Aβ的药物开发屡屡失败使得许多药物研发工作者将目光tau蛋白。但是近几年一些靶向tau相关病理的药物同样由于在临床试验中未能达到有效临床终点而宣告失败[5，53]。AD药物研发的临床试验反复失败的原因之一可能是缺乏能够全面模拟AD复杂发病机制的临床前研究模型。本文在分子、细胞、动物以及计算机模拟4个水平上，总结了基于tau病理药物研究的常用实验方法及模型。这些方法模型各有利弊，研究人员可以根据自身条件及药物研发所处阶段选择不同的模型。

竖井工程除井口部设置了单层SSm明洞衬砌外，其余地段均采用复合式衬砌；复合式衬砌是在竖井开挖完成后进行初期支护的施工，待其达到设计强度后施工二次衬砌；初期支护由系统锚杆、双层钢筋网、格栅钢架、喷射混凝土组成，一般情况下二次衬砌采用素混凝土，以方便施工，但在V级围岩以及洞口浅埋地段为了保证隧道的施工安全和整体的结构稳定性，二次衬砌使用钢筋混凝土施工。另外初期支护与二次衬砌之间铺设300 g/m2土工布、1.5 mm厚单面自粘防水板作为复合防水层。

目前尚未建立一种模型可以很好地模拟AD的全部病理特征。研究人员在药物开发的临床前研究中可以尽可能采用人源化的实验材料，或是结合多种模型综合分析以得到更可靠的结论，利用计算机模拟技术提升发现潜在药物的速度和准确性。此外，可以有效诊断早期AD标志物的研究对药物的开发也具有很强的推动作用。临床前研究成果向临床转化失败率很高的一个可能原因是，根据目前临床前疾病模型筛选出的潜在药物极有可能是适用于相对早期的AD患者，而临床招募的患者大多数是已经表现出临床症状的中晚期患者。如果能有效地筛查出早期AD患者，可能可以开展不同适应阶段的临床试验，降低临床前研究的失败率。在世界各国研究者的共同努力下，随着对AD发病机制了解的不断深入，相信AD的药物开发会有快速的发展和突破。