嵌合抗原受体 T细胞治疗实体瘤的研究进展

贾琳，李丽茹，张清媛

哈尔滨医科大学附属肿瘤医院乳腺内科，哈尔滨 150011

嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor-T，CAR-T）细胞治疗已从抗肿瘤临床前研究发展为被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）批准用于血液学恶性肿瘤治疗和临床级生产。但目前实体肿瘤对CAR-T细胞疗法并不敏感。T细胞能识别肿瘤相关抗原，并建立长期记忆[1]。但肿瘤接近正常细胞时，更容易发生免疫逃逸。目前，多项研究均在试图通过改造T细胞来克服实体瘤的免疫逃逸机制，进而提高T细胞的抗肿瘤作用。

过继细胞疗法（adoptive cell therapy，ACT）是将在体外富集并大量扩增的自体免疫细胞注入肿瘤患者体内以特异性杀死肿瘤细胞。ACT主要包括以下两种方法：①将肿瘤浸润淋巴细胞在体外扩增后回输到宿主体内[2]。②分离宿主外周血淋巴细胞，利用基因工程技术引入新的基因，再回输到宿主体内从而靶向杀死肿瘤细胞，如T细胞受体基因工程改造的T细胞（T cell receptor-gene engineered T cell，TCR-T）疗法[3]、CAR-T疗法[4]。

CAR即嵌合抗原受体，由可以识别肿瘤相关抗原的胞外结构域、跨膜区域和胞内信号结构域组成[4]。CAR重组生成的特异性受体可以不受组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子的限制而独立识别细胞表面抗原，从而避免肿瘤通过下调MHC进行免疫逃逸[5-6]。1993年，第一代CAR-T细胞被研发出来，由于其在体内的持续扩增有限，虽然可激活T细胞，但抗肿瘤效果较弱，不具备大规模杀灭肿瘤细胞的能力[7-8]。随着CAR技术的不断优化，只包含CD3ζ部分的TCR也被第二代CAR取代。第二代CAR是在第一代基础上增加了一个共刺激分子信号（如CD28），只有同时与CD28共刺激域和CD3ζ的免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM）结合才可以激活T细胞，这种双信号模型在维持T细胞持久增殖的同时，还可以降低自身抗原与TCR结合导致的自身免疫反应发生率[9]。除CD28外的其他共刺激域，如CD27、4-1BB和OX40，也可明显改善CAR-T细胞的功能和体内持久性[10-11]。

CAR-T细胞治疗白血病和淋巴瘤的效果显著，使越来越多的基础和临床研究者试图将其应用于实体肿瘤的治疗上。但目前对实体肿瘤的研究结果仍然有限，这主要是因为实体瘤缺乏肿瘤特异性抗原，即使选择了合适的肿瘤靶抗原，CAR-T细胞也很难靶向运输至肿瘤组织[12]，且CAR-T细胞也无法长期有效的在宿主体内增殖[13]；此外，即使CAR-T细胞可以到达肿瘤组织，肿瘤免疫微环境也会抑制T细胞对肿瘤细胞的作用，抑制CAR-T细胞的克隆[14]。上述因素整体影响了CAR-T细胞在实体瘤中的疗效。本文对目前CAR-T细胞治疗实体瘤的困难和可能的解决策略进行综述。

1 肿瘤异质性

肿瘤特异性抗原，如表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（epidermal growth factor receptor variant typeⅢ，EGFRvⅢ）[15]，可在肿瘤细胞上特异性表达，是CAR-T细胞治疗的理想靶点之一。靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞仅攻击肿瘤组织，而几乎不损害正常组织。此外，也可以选择肿瘤相关抗原作为治疗靶点，如肿瘤细胞人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达水平明显高于正常细胞[16]。组织特异性抗原，如前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）[17]，在胰腺或膀胱等正常组织中表达水平非常低，一般情况下，杀灭PSCA阳性细胞不会导致重要器官衰竭，因此，几乎可以忽略CAR-T细胞治疗对其他组织的影响。

实际上，肿瘤进展过程中，表面抗原会出现异质性和遗传不稳定性，且同一肿瘤的不同转移部位抗原的表达也会存在差异。肿瘤异质性成为影响CAR-T细胞治疗效果的主要因素，缺乏肿瘤特异性抗原会明显增加脱靶毒性的风险[18]。据报道，1例转移性结肠癌患者在接受了HER2靶向CAR-T细胞输注治疗5天后死亡，死亡原因为CAR-T细胞对HER2表达低水平的肺细胞的毒性[19]。另1例脱靶毒性已经在对神经母细胞瘤具有高亲和力抗GD2 CAR的临床前模型中描述，该模型中，大脑低水平的GD2导致了致命性的脑炎[20]。Thistlethwaite等[21]报道了1例患者因癌胚抗原相关细胞黏附分子 5（carcinoembryonic antigen related cellular adhesion molecule 5，CEACAM5）特异性CAR-T细胞对肺细胞和肺相关巨噬细胞脱靶效应而导致急性呼吸窘迫，该研究因严重非预期毒性而终止。这些致命的安全事件强调了选择合适的肿瘤相关抗原的重要性，因为即使正常组织中靶向抗原的低水平表达也会导致严重的毒性。可能的解决方案是设计串联型CAR同时攻击多个肿瘤抗原，这样尽管失去了一个靶标抗原，仍然可以通过与其他抗原结合发挥抗肿瘤活性。2021年的一项Ⅰ期临床试验（NCT04007029）的数据显示，双特异性抗CD19/CD20的CAR-T细胞疗法在复发/难治性B细胞淋巴瘤的治疗中展现出了良好的临床疗效及耐受性[22]。此外，多靶点选择除可以增强CAR与肿瘤细胞的结合外，还可以将脱靶效应降到最低。

近年来，通用的CAR-T细胞已经被开发出来[23-24]，使其对特异性抗原的活性有所提高，其使用“第三方”适配器，拆分抗原靶向结构域和T细胞信号单位，使CAR-T细胞拥有识别多种抗原的能力。虽然目前临床批准的CAR具有持续活性，但使用适配器时，适配器介导的CAR-T具有可逆的安全开关，可以只识别和杀死抗原表达的靶细胞，安全性明显提高。目前，一项研究CD123靶点模块相关的通用CAR02-T在CD123阳性的血液学恶性肿瘤患者中作用的Ⅰ期（NCT04230265）临床试验正在进行[25]。

2 CAR-T细胞的扩增和归巢

CAR-T细胞转移至肿瘤对血液学肿瘤来说似乎不是主要问题，但对于实体瘤来讲可能是一个挑战。靶向实体肿瘤的CAR-T细胞一旦注入，不会迅速遇到它们的靶细胞[26]，这种必要的进入肿瘤组织的时间，限制了CAR-T细胞在实体瘤中的增殖性和持久性，从而抑制了其疗效。在难治性大B细胞淋巴瘤中，注入抗CD19的CAR-T细胞后观察到的高客观缓解率与注射后CAR-T细胞的高增殖率有关[27]。因此，正常的CD19+B细胞可作为抗原的迅速增殖和自我更新的来源。有学者提出改造抗CD19 CAR-T细胞，使其通过表达融合蛋白识别多个不同靶点，并同时保持高增殖性和持久性。融合蛋白包含一个CD19细胞外结构域和一个抗肿瘤抗原结合结构域，可以使抗CD19 CAR-T细胞作用于多个肿瘤靶抗原[28]。这项研究对于CAR-T细胞治疗实体瘤似乎很有吸引力。

一些研究表明，可以修饰CAR-T细胞使其表达与靶细胞分泌的趋化因子[CC趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR）2[29]、CCR4[30]、CXC趋化因子受体（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR）2[31-32]]匹配的受体，进而改善T细胞对肿瘤的归巢和体内的抗肿瘤疗效。在胶质母细胞瘤、卵巢癌和胰腺癌的异种移植小鼠模型中，趋化因子受体，如CXCR1或CXCR2的过表达也提高了肿瘤组织内CAR-T细胞的持久性和肿瘤缓解率[33]。

另一种解决CAR-T细胞迁移的方法是直接将CAR-T细胞注射到肿瘤组织中。一些临床前研究表明，与静脉推注相比，局部给药具有更高的CAR-T细胞活性、疗效和持久性，这种方法更适用于具有天然屏障的肿瘤（如中枢神经系统肿瘤）[34-35]。Mulazzani等[36]使用颅内双光子显微镜证明，在原发中枢神经系统淋巴瘤小鼠模型中，脑内注射抗CD19 CAR-T细胞可有更明显的浸润，并有效控制肿瘤生长；有趣的是，脑内注射CAR-T细胞28天后，远处的非引流淋巴结中仍可检测到CAR-T细胞；甚至在中枢神经系统淋巴瘤完全消退后，抗CD19 CAR-T细胞在大脑和血液中仍持续存在了159天。

目前，关于颅内注射和静脉注射两种途径的脑肿瘤临床试验均在进行中，与静脉注射相比，颅内注射更危险[37]。此外，一项研究报道了8例继发性中枢神经系统淋巴瘤患者单次静脉注射了tisagenlecucel[含有4-1BB（即CD137）共刺激域的抗CD19 CAR-T细胞]治疗后，总有效率为50%[38]，未提高细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）发生率或神经毒性。这项回顾性研究表明，静脉注射CAR-T细胞可有效地将其运输至中枢神经系统，但还需要更大规模的前瞻性研究来阐明最佳的运输途径。另一方面，当CAR-T细胞直接注射到肿瘤区域时，减少CAR-T细胞的剂量是否合适仍然需要探讨。有研究对6例转移性（皮肤或淋巴结转移）乳腺癌患者肿瘤组织内注射CAR-T细胞的疗效进行了研究[39]，该研究应用了先前经瞬时mRNA转染制备的c-met CAR-T细胞[40]，其瞬时表达降低了其脱靶效应的风险，该研究结果显示，尽管在肿瘤内可以检测到炎症反应，但并没有观察到肿瘤组织内注射CAR-T细胞具有有效的抗肿瘤作用。

由此可见，为提高CAR-T细胞在实体瘤中的扩增能力、归巢能力和持久性，临床前模型已经研究了多种方法。一些方法已经在临床研究中得到了评估，但还需要更多的试验来更好地评估其疗效。

3 肿瘤免疫抑制微环境

一些实体瘤产生免疫抑制环境会影响ACT的疗效[41]。目前也研究了多种方法来改进CAR-T细胞，使其能够在免疫抑制环境中增殖、存留和起效。与第一代CAR相比，第二代CAR引入一个共刺激结构域CD28或4-1BB，使CAR-T细胞免疫活性激活的问题得到了明显改善，并使其作用更加持久。CD28共刺激可以提供强大的细胞活性和扩增反应，但也有其不可忽视的负性影响，即缩短了CAR-T细胞的长期持久性。CD137能够改善CAR-T细胞的长期持久性，延长CD8+T细胞的记忆[42]。但与以CD28和4-1BB作为共刺激诱导的CAR-T细胞疗效相比，仅以CD28作为共刺激对PSCA有特异性的CAR-T细胞在实体肿瘤模型中的抗肿瘤免疫应答效果更好。因此，仍然需要优化CAR-T细胞不同共刺激域的比例来提高CAR-T细胞的性能。

此外，也可以诱导局部释放促进抗肿瘤免疫反应的刺激因子，来重塑肿瘤免疫微环境以提高ACT的功效。最新一代“装甲”CAR-T细胞，也称为TRUCK，既具有共刺激因子又具有细胞因子，可能成为治疗与免疫抑制微环境相关的实体瘤的希望。这些CAR-T细胞通过基因修饰来表达有效的细胞因子，其中，白细胞介素（interleukin，IL）-12和IL-18最有望用于重塑肿瘤微环境。IL-12是一种促炎细胞因子，能够改善T细胞活性，诱导CD4+辅助性T（helper T，Th）1细胞应答、CD8+细胞克隆扩增和效应功能；IL-12还能将自然杀伤（natural killer，NK）细胞招募到肿瘤部位，重新激活肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）、抑制调节性T（regulatory T，Treg）细胞和肿瘤相关巨噬细胞分泌IL-10、IL-4和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。IL-12 TRUCK在血液学肿瘤[43]和实体瘤[44]的临床前模型中均显示了良好疗效。Chmielewsk等[45]通过细胞因子筛选发现，IL-18在CAR-T细胞中诱导了信号通路中T-Bet高表达、叉头框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）低表达，进而设计了一种IL-18 TRUCK，与不分泌细胞因子的CAR-T细胞相比，IL-18 TRUCK提高了具有免疫功能的晚期胰腺癌小鼠的存活率。此外，IL-18 CAR-T细胞治疗诱导了肿瘤微环境的重塑[46]。

CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂（immune inhibitor of checkpoint，ICI），如程序性死亡受体 1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）、程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）结合是另一种重塑肿瘤微环境的有效方法。临床前数据表明，抗PD-1抗体的使用增强了CAR-T细胞对HER2+肉瘤和乳腺癌细胞株的抗肿瘤活性[47]。抗PD-1治疗可作用于TIL和CAR-T细胞，后者通常在抗原刺激后出现PD-1表达上调。为限制全身输注ICI的毒性和提高肿瘤局部药物浓度，Rafiq等[48]设计出“装甲”CAR-T细胞，使其只在局部肿瘤部位分泌PD-1以阻断Aβ特异性单链抗体（single chain variable fragment，scFv）。有趣的是，在转移性卵巢癌异种移植小鼠模型中，与使用抗MUC16ecto-CAR-T细胞联合抗PD-1抗体治疗的小鼠相比，使用这种“装甲”CAR-T细胞小鼠的存活率明显提高，这种方法有望使CAR-T细胞治疗在具有免疫抑制微环境的肿瘤中起效。此外，分泌抗PD-L1抗体的靶向碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ）CAR-T细胞在肾透明细胞癌的人源小鼠模型中，显示出比单独抗CAⅨCAR-T细胞更好的肿瘤控制效果[49]。但CAR-T细胞与ICI结合的临床获益目前尚未得到明确证实。一项Ⅰ期临床试验中，PD-1抑制剂与抗GD2 CAR-T细胞联合使用并没有改善神经母细胞瘤患者的抗肿瘤反应[50]。

另有学者设计了对抑制信号没有反应的CAR-T细胞，如通过基因编辑去除CAR-T细胞中的PD-1受体，使其对PD-1/PD-L1抑制通路失去活性[51]。还可以通过使一些受体（如TGF-β[52]或PD-1[53]）突变，使CAR-T细胞对抑制信号无反应。但这种设计增加了CAR-T细胞过度激活的风险，因为免疫抑制途径是调节T细胞效应功能的关键，应用时应特别注意和密切监测不良反应。

Porter等[54]发现，编码IL-12、抗PD-L1抗体和针对CD44v6的特异性BiTE腺病毒（即CAdTrio溶瘤病毒）与抗HER2 CAR-T细胞联合应用比单独应用可以更有效地控制头颈部鳞状细胞癌的疾病进展。尽管有点超前，但这种方法同时使用了瘤内注射和静脉注射，可能能够有效克服实体瘤抗原异质性和肿瘤免疫抑制微环境。

4 小结与展望

CAR-T细胞已在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了巨大的突破。第二代CAR-T细胞包含一个共刺激域（通常是CD28或4-1BB），目前已广泛用于复发/难治性B细胞急性淋巴母细胞白血病和融合大B细胞淋巴瘤的治疗。这一成功使学者对CAR-T细胞靶向治疗实体瘤产生了极大的兴趣，但第二代CAR-T细胞在实体瘤的疗效评估临床试验中显示了令人失望的结果。虽然已经观察到一些肿瘤完全缓解，但缓解的持续时间仍然有限。为有效实现CAR-T细胞治疗实体瘤还需要克服的障碍包括肿瘤抗原异质性、CAR-T细胞归巢能力和肿瘤免疫抑制微环境。目前，可以阻断实体瘤的所有逃避机制的CAR-T细胞模式还未被发现，TRUCK在临床前研究中已经展示了良好的效果，有望使第二代CAR-T细胞的抗肿瘤活性得到增强。

由于CAR-T细胞相关的毒性通常是急性出现的，理想的控制机制应该能够快速控制CAR-T细胞的活性。永久消除CAR-T细胞可能会消除其长期的抗肿瘤作用，因此，多种方法都是针对配体可逆控制，允许在出现毒性时迅速关闭CAR-T细胞，如设计适配CAR-T细胞。此外，也可以通过设计具有更高靶向特异性和组织选择性的自主CAR，使其能够更好地区分肿瘤细胞和正常细胞。未来，也可根据肿瘤类型来选择CAR-T细胞，因为组织特异性血管化可以影响CAR-T细胞的生物分布、浓度和在受累器官中的持久性。目前，多项CAR-T细胞治疗实体瘤的临床研究正在进行中，期待可以得到令人振奋的结果来为实体瘤提供新的治疗策略。