基于HPLC-QAMS多指标成分含量测定联合化学计量学的恒古骨伤愈合剂质量控制△

冯晓川，徐延昭，张静，张蕊*

1.北京积水潭医院 中药房，北京 100035；

2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

恒古骨伤愈合剂由杜仲、三七、人参、红花、陈皮、黄芪、洋金花、钻地风和鳖甲加工而成，具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的临床功效，主要用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症，现收载于《中华人民共和国药典》2020 年版（一部）[1]。其中仅对陈皮所含成分橙皮苷进行了定量控制，也仅检索到对该制剂所含药味进行薄层鉴别或1～2 个成分进行含量测定的相关报道[2-3]。中药及其复方制剂是多组分协同发挥疗效的，但现有质量控制手段不能涵盖多组分检测，更不能有效保证其疗效。近年来，高效液相色谱-一测多评法（HPLCQAMS）越来越多地运用到中药及其复方制剂质量控制研究中，该方法通过选取质稳价廉的1 个成分作为内参物，建立其与其他成分的相对校正因子（RCF），在一定程度上降低了检验成本，为多成分质量控制方法的应用与普及提供了便利条件[4-5]。同时，化学计量学方法通过对多批样品中多个成分含量数据进行提取和降维分析，挖掘繁杂数据间的内在关系，找出可能对质量控制有显著贡献的主要成分[6-7]。本研究选取恒古骨伤愈合剂中君药红花和三七、臣药人参和杜仲、佐药陈皮为研究对象，分析研究其所含成分，最终以红花的主要成分羟基红花黄色素A 和红花黄色素A，三七和人参所含主要共有成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，杜仲所含主要有效成分京尼平苷酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷，陈皮所含主要药效成分芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素为指标，同时以出峰时间居中、质量稳定的羟基红花黄色素A 作为内参物，采用HPLC-QAMS 对上述11 个成分含量进行同步测定，同时通过化学计量学方法挖掘多指标成分含量数据间潜在关系，为提升恒古骨伤愈合剂的质量控制水平提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪［岛津仪器（中国）有限公司］；e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；XS205型电子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

对照品京尼平苷酸（批号：111828-201805，纯度：98.1%）、京尼平苷（批号：110749-201919，纯度：97.1%）、松脂醇二葡萄糖苷（批号：111537-202107，纯度：93.4%）、三七皂苷R1（批号：110745-201921，纯度：90.4%）、人参皂苷Rg1（批号：110703-202034，纯度：94.0%）、人参皂苷Rb1（批号：110704-202129，纯度：94.3%）、羟基红花黄色素A（批号：111637-202111，纯度：96.8%）、橙皮苷（批号：110721-202019，纯度：95.3%）、川陈皮素（批号：112055-202102，纯度：99.7%）均购于中国食品药品检定研究院；红花黄色素A（批号：PRF8101143，纯度：98.5%）、芸香柚皮苷（批号：PRF9062802，纯度：99.8%）均购于成都普瑞法科技开发有限公司；乙腈和磷酸为色谱纯；水为纯净水；其余试剂均为分析纯。

恒古骨伤愈合剂（规格：每瓶25 mL）来源于赛灵药业科技集团股份有限公司，批号分别为20210519、20210521、20210522、20210621、20210622、20210707、20210714、20210909、20210911、20210926、20211119、20211124、20211126、20211127、20211219，编号分别为S1～S15。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

精密称取对照品京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、羟基红花黄色素A、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素并用50%甲醇制成质量浓度分别为0.178、0.192、0.234、0.950、0.378、0.336、0.442、0.270、0.418、1.310、0.116 mg·mL-1的混合对照品储备液，再进一步用50%甲醇稀释20 倍得质量浓度分别为8.90、9.60、11.70、47.50、18.90、16.80、22.10、13.50、20.90、65.50、5.80µg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

精密量取恒古骨伤愈合剂5 mL，用50%甲醇定容至25 mL，摇匀，即得恒古骨伤愈合剂供试品溶液。取按处方比例及工艺制备的缺杜仲、缺三七和人参、缺红花、缺陈皮的阴性样品，按前述方法制得阴性样品溶液。

2.3 色谱条件及专属性试验

色谱柱：Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；以0.1%磷酸-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～11 min，10%B；11～21 min，10%～24%B；21～36 min，24%～30%B；36～47 min，30%～50%B；47～62 min，50%～64%B；62～70 min，64%～10%B）；流速为1.0 mL·min-1；检测波长分别为235 nm[8-10]（0～21 min 检测京尼平苷酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷）、203 nm[11-15]（21～36 min 检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1）、403 nm[16-18]（36～47 min 检测羟基红花黄色素A 和红花黄色素A）和283 nm[19-22]（47～70 min 检测芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素）；进样量体积为10 µL。在上述色谱条件下进样混合对照品溶液及供试品溶液，记录色谱图（图1）。结果显示，恒古骨伤愈合剂供试品溶液中11 个成分与相邻色谱峰分离良好，阴性供试品无干扰。

图1 混合对照品和恒古骨伤愈合剂供试品HPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别用50%甲醇稀释200、100、40、20、10、4倍，得6个系列质量浓度的混合对照品溶液1～6，依次按2.3 项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X）进行线性回归（表1）。结果表明，对照品在各自质量浓度范围内线性关系具有良好线性关系。

表1 恒古骨伤愈合剂中11个成分的线性关系

2.4.2 精密度试验 按2.3 项下色谱条件重复进样恒古骨伤愈合剂（S1）同一份供试品溶液6次，11个成分峰面积的RSD为0.76%～1.41%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取一份恒古骨伤愈合剂（S1）供试品溶液，于0、2、4、7、12、24、36 h 按2.3项下色谱条件进样检测，得11 个成分峰面积的RSD为0.74%～1.39%，表明恒古骨伤愈合剂供试品溶液在36 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 按2.2 项下方法制备6 份恒古骨伤愈合剂（S1）供试品溶液，按2.3 项下色谱条件检测分析，用外标法计算含量，得11 个成分含量的RSD为1.01%～1.89%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密吸取恒古骨伤愈合剂（S1）9 份，每份2.5 mL，均分成3 组，精密加混合对照品溶液（京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、羟基红花黄色素A、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素质量浓度分别为0.147、0.178、0.209、0.704、0.326、0.283、0.395、0.232、0.351、0.896、0.104 mg·mL-1）0.8、1.0、1.2 mL，每个质量浓度3份，再按2.2项下方法制备供试品溶液，依法检测，得回收率及RSD 分别为96.81%（0.60%）、98.33%（1.43%）、98.72%（1.17%）、100.12%（0.77%）、98.69%（1.25%）、98.47%（1.25%）、99.13%（0.92%）、96.83%（0.78%）、97.87%（1.63%）、100.21%（0.71%）、98.35%（1.18%）。

2.5 HPLC-QAMS

2.5.1 RCF 计算 本研究以羟基红花黄色素A 为内参物计算京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素的RCF。取线性关系考察中的6 个对照品溶液进样，按公式（1）计算各成分RCF（表2）。

表2 恒古骨伤愈合剂中各成分的RCF

式中ƒ为RCF、W为质量浓度、A为峰面积、k为内参物、s为其他待测成分。

2.5.2 仪器与色谱柱对RCF影响的考察 本研究考察了2 个品牌的色谱仪（LC-20AT 型、e2695 型）及3种色谱柱（Alltima C18、Nucleosil C18和Aquasil C18，规格均为250 mm×4.6 mm，5 μm）对RCF 的影响。在2.3 项下色谱条件下进样混合对照品溶液，结果测得各成分RCF 的RSD 为0.70%～1.55%（表3），说明仪器与色谱柱对RCF无影响。

表3 不同HPLC仪及色谱柱对恒古骨伤愈合剂各成分RCF的影响

2.5.3 流速对RCF 影响的考察 其他色谱条件不变，流速分别为0.8、1.0、1.2 mL·min-1时，进样对照品溶液，结果测得各成分RCF 的RSD 为0.37%～1.62%（表4），说明流速对RCF无影响。

表4 流速对恒古骨伤愈合剂各成分RCF的影响

2.5.4 柱温对RCF 影响的考察 其他色谱条件不变，采用柱温为25、30、35 ℃条件下，进样对照品溶液，结果测得各成分RCF 的RSD 在0.37%～1.69%（表5），说明柱温对RCF无影响。

表5 柱温对恒古骨伤愈合剂RCF的影响

2.5.5 色谱峰定位的考察 本研究为对待测成分色谱峰进行定位，考察了色谱仪（LC-20AT 型、e2695 型）及色谱柱（Alltima C18、Nucleosil C18和Aquasil C18）对相对保留时间值（RRT）的影响。在2.3 项下色谱条件下，进样对照品溶液，结果测得京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷、川陈皮素和羟基红花黄色素相对保留时间的RSD 为0.57%～1.61%（表6），表明该法可以对待测成分色谱峰进行准确定位。

表6 仪器及色谱柱对恒古骨伤愈合剂各成分RRT的影响

2.6 2种方法测定含量的对比

取15 批恒古骨伤愈合剂（S1～S15），根据2.2项下方法制备恒古骨伤愈合剂供试品溶液，按2.3项下色谱条件下进样分析，分别运用ESM 和HPLCQAMS 计算恒古骨伤愈合剂中11 个成分的含量。结果说明2 种方法差异无统计学意义（表7），表明HPLC-QAMS 可用于恒古骨伤愈合剂中11 个成分的含量测定。

表7 QAMS与ESM对恒古骨伤愈合剂中11个成分含量的测定结果（n=3） mg·g-1

3 恒古骨伤愈合剂的化学计量学质量分析

3.1 聚类分析（CA）

将15 批恒古骨伤愈合剂中11 个成分QAMS 所得数据导入SPSS 26.0 统计软件进行CA（欧氏距离的组间联接），见图2。结果显示，当间距为15 时，15 批样品聚为3 类，S4、S7、S2、S5、S3、S6、S1共7 批样品聚为一类，S8～S10 共3 批样品聚为一类，S11～S15共5批样品聚为一类。

图2 15批恒古骨伤愈合剂样品聚类树状图

3.2 主成分分析（PCA）

运用SPSS 26.0统计软件对2.6项下QAMS测定结果进行PCA，得各主成分特征值、方差贡献率和累积方差贡献率（表8）及成分矩阵（表9）。由表8 可知，特征值＞1 的有2 个主成分对应方差的贡献率分别为66.169%、22.223%，累积方差贡献率为88.393%，表明选取2 个主成分即可代表恒古骨伤愈合剂中11 个成分88.393%的信息，具有较好的代表性。表9 可以看出，第一主成分的信息来于京尼平苷酸、松脂醇二葡萄糖苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素的综合，第二主成分的信息来于京尼平苷、三七皂苷R1和羟基红花黄色素A 的综合。同时应用统计软件SIMCA 14.1 建立PCA 模型，得15 批恒古骨伤愈合剂样品PCA 得分图（图3），共提取出2 个主成分，模型对X变量可解释率（R2X）为0.884，超过0.5，所建立的模型稳定性较高。从图3 可以看出，S1～S7、S8～S10 及S11～S15 分别呈现一定关联性。

图3 15批恒古骨伤愈合剂样品PCA 得分

表8 恒古骨伤愈合剂中特征值、方差贡献率和累积方差贡献率

表9 恒古骨伤愈合剂中11个成分的成分矩阵

3.3 PLS-DA

PLS-DA通过对数据的分析能够查找出引起产品质量差异的特征成分，SIMCA 14.1 统计软件对2.6项下QAMS含量数据运行PLS-DA 程序，见图4。结果R2X为0.896，模型对Y变量可解释率（R2Y）为0.843，预测能力参数（Q2）为0.784，理论上R2Y、Q2数值越接近1，说明模型越好，通常两者超过50%时所建立的模型稳定可靠、预测能力强。由图4 可以看出，15 批恒古骨伤愈合剂的含量数据点均落在95%置信区间内，根据分布可分为3 类，与CA 和PCA结果一致。

图4 15批恒古骨伤愈合剂样品的PLS-DA模型得分图

对建立的PLS-DA 模型进行200 次置换检验（图5），结果显示，累积方差值（R2）拟合直线Y轴截距为0.092＜0.3；Q2拟合直线Y轴截距为-0.274，Q2为负数，且最右边的R2和Q2值均高于左侧，表明所构建的PLS-DA 模型不存在过度拟合，预测能力好，可有效判别分析15 批恒古骨伤愈合剂的质量差异。根据变量重要性投影（VIP）值筛选影响药物炮制前后组方恒古骨伤愈合剂化学成分差异的标志性成分（图6），结果VIP 值＞1 的有5 个成分，即成分7（羟基红花黄色素A，VIP 值=1.446）、成分4（三七皂苷R1，VIP值=1.351）、成分10（橙皮苷，VIP值=1.258）、成分2（京尼平苷，VIP值=1.138）、成分5（人参皂苷Rg1，VIP 值=1.067）对恒古骨伤愈合剂样品质量的影响较大，可能是影响恒古骨伤愈合剂产品质量的主要潜在标志物。

图5 15批恒古骨伤愈合剂PLS-DA模型置换检测结果

图6 15批恒古骨伤愈合剂样品中11个成分的VIP（, n=15）

4 讨论

4.1 检测指标性成分的选择

恒古骨伤愈合剂配方中君药包括红花和三七，有活血化瘀的功效；人参、黄芪益气健脾，杜仲、鳖甲补肝肾、强筋骨，4 味药合为臣药；陈皮理气和中，钻地风舒筋活络，洋金花止痛，三者为佐药。诸药合用，共奏活血益气、益肝肾、接骨续筋、消肿止痛之功效。本研究综合考虑，以君药红花和三七，臣药人参和杜仲，佐使药陈皮为考察对象，分析其所含成分，选取主要成分、特征性成分或主要药效成分为检测指标。最终本研究确定以京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇二葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、羟基红花黄色素A、红花黄色素A、芸香柚皮苷、橙皮苷和川陈皮素为检测指标。

4.2 供试品溶液制备

本研究在制备供试品溶液时，考虑到该制剂在制备时已进行了提取浓缩，且该制剂为液体制剂，参考相关文献，首先对提取溶剂进行了筛选[9,12-14,16-17,19-22]：甲醇、70%甲醇、60%甲醇、50%甲醇和25%甲醇，并采用直接稀释法。结果发现50%甲醇提取时，所测11 个成分的提取率较高。进而采取超声和加热回流提取方式进行了对比，结果发现50%甲醇超声提取和直接稀释时11 个成分的提取率相当。综合考虑，最终确定以50%甲醇直接稀释为恒古骨伤愈合剂供试品溶液最佳制备方式。

4.3 化学计量学分析结果评价

化学计量学运用数学、统计学、计算机科学等学科理论和方法，通过解析化学检测数据，发掘多变量复杂数据中存在的关联关系，CA、PCA、非线性映射等无监督统计方法和PLS、PLS-DA、正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等有监督统计方法近年来广泛应用于中药及其制剂的研究中。CA利用同类样品彼此相似，在多维空间中彼此距离较小的原理，达到对未知样本进行分类的目的。本研究对QAMS 测定结果进行CA，15 批恒古骨伤愈合剂聚为3 类，即S4、S7、S2、S5、S3、S6 和S1 聚为一类，S8～S10 聚为一类，S12～S15 聚为一类，表明恒古骨伤愈合剂具有明显分类趋势。PCA 将具有一定相关性的变量通过数据降维，排除众多化学信息共存中相互重叠的信息，在保存大量信息的同时降低了变量个数，对成分复杂的中药及其制剂研究具有重要意义。本研究PCA 结果显示，选取2 个主成分即可代表恒古骨伤愈合剂中11 个成分88.393%的信息，具有较好的代表性，同时15 批样品分类与CA 结果一致。PLS-DA 通过模式识别发掘引起产品质量差异的特征成分。本研究对11 个成分含量检测结果进行PLS-DA，将PLS-DA 模型进行200 次置换检验，结果显示，所构建的PLS-DA 模型不存在过度拟合，预测能力好，可有效判别分析15 批恒古骨伤愈合剂的质量差异，筛选出羟基红花黄色素A、三七皂苷R1、橙皮苷、京尼平苷和人参皂苷Rg1为影响产品质量差异的标志性化学成分，为不断提升恒古骨伤愈合剂的质量控制标准提供参考。

本研究采用HPLC-QAMS 建立了恒古骨伤愈合剂11 个指标成分定量质量控制模式，对市场流通的15 批样品进行检测，通过方法学验证及2 种方法的对比，结果显示2 种方法差异无统计学意义；又通过化学计量学识别模式对多指标成分含量检测结果进行提取、降维分析，发现羟基红花黄色素A、三七皂苷R1、橙皮苷、京尼平苷和人参皂苷Rg1可能是影响产品质量差异性的主要物质性成分，提示药企在生产该制剂时要关注相关药材的质量，全面保证制剂临床疗效，为提高恒古骨伤愈合剂质量控制水平提供参考。