基于网络药理学和分子对接的当归六黄汤治疗围绝经期综合征作用机制研究△

汤春花，梁凤友，高永坚，曾杉，李秀娴，陈雨平，李静荣

国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305

多数45～55岁的女性体内雌激素和孕激素逐渐减少，月经周期的频率发生改变，最初被称为更年期前期，月经停止12 个月时，被称为更年期，也称围绝经期（perimenopausal）。这一阶段除了月经周期的改变外，还会出现如潮热、盗汗、失眠、情绪低落、泌尿生殖系统不适等症状，这一系列的表现也称为围绝经期综合征（perimenopausal syndrome，PMS）[1-2]。目前临床上对于PMS 多采用雌激素替代疗法，但这一疗法不良反应较大、疗效不理想[3-4]，许多人无法耐受。因此，亟须进一步探讨PMS 的发病机制，为PMS的治疗提供新的安全、有效、耐受的治疗药物。

中医理论中，雌激素和其他激素统称为精，精藏在中医的“肾”实体中，是所有阴阳的起源。PMS 是由于精的减少，导致阴阳之间的平衡紊乱等多种症状，潮热盗汗即是阴无法抑制阳的活动的信号。《黄帝内经》中描述围绝经期：“女子七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”［5］“天癸”是肾精肾气充盛到一定程度时，体内出现的具有促进生长、发育、生殖的一种物质，故PMS 的发生主要以肾虚为主。栗春芳等[6]认为肾为五脏阴阳之本，肾虚导致脏腑功能失调，出现各种临床症状。综上，肾阴虚是PMS 发生的根本原因，肾阴不足，不能上济心火，则心火偏亢，至虚火伏藏阴分，寐则卫气行于阴，助长阴分伏火，两阳相加，迫使阴液汗出而盗汗。

当归六黄汤源于金代名医李杲的《兰室秘藏》，由当归、生地黄、熟地黄、黄芩、黄柏、黄连、黄芪7 味药组成，功能主治为滋阴泻火、固表止汗[7]，《兰室密藏》卷下称当归六黄汤为“治盗汗之圣药也”［8］。现代研究表明，当归六黄汤治疗阴虚火旺型围绝经期综合征疗效确切，治疗后患者雌二醇水平显著高于化学药组，黄体生成素、卵泡刺激素显著低于化学药组，且不良反应发生率低，用药安全性更高[9]。但当归六黄汤治疗PMS 的作用机制尚不明确。

本研究采用网络药理学，通过多组分、多靶点、多通路的筛选，网络可视化和网络拓扑学分析，阐明药物、靶点和疾病之间复杂的网络关系，预测和分析中药的多靶点作用机制，为当归六黄汤治疗PMS提供参考。

1 材料与方法

1.1 当归六黄汤活性成分和靶点筛选

分别以当归、黄芪、熟地黄、生地黄、黄芩、黄连、黄柏为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索当归六黄汤的全部活性成分，建立当归六黄汤化学成分数据库。采用口服生物利用度（OB）、类药性（DL）2 项指标评价当归六黄汤活性成分的成药性。设置OB≥30%、DL≥0.18 筛选活性成分，并获取活性成分对应蛋白靶点。将蛋白靶点数据输入UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/），选择物种为人，进行归一化和标准化命名，删除没有对应基因名称的目标蛋白，获得活性成分对应的靶点基因。通过文献报道[10]完善生地黄的活性成分和靶点信息。

1.2 PMS 靶点筛选及其与活性化合物交集靶点的分析

通过GeneCards（https://www.genecards.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://www.omim.org/）数据库获取与PMS相关的靶点，将1.1 项下获取的活性成分靶点和PMS 疾病靶点导入微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）在线作图网站，绘制韦恩图，得到活性成分-PMS的交集靶点。

1.3 药物-活性成分-交集靶点网络构建

将1.2项下获取的活性成分和对应的交集靶点数据导入Cytoscape 3.7.1软件，建立药物-活性成分-交集靶点网络图，并采用软件中的“Network Analyzer”功能进行网络拓扑分析，筛选出核心活性成分和潜在靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建及拓扑分析。

将1.2项下获取的交集靶点导入STRING（https://cn.string-db.org/）数据库，选择“Multiple proteins”，种属设置为“Homo sapiens”，Interaction score 设定为0.400，并选择隐藏散在的节点，获取交集靶点的PPI网络。将PPI网络的结果导入Cytoscape 3.7.1软件中进行可视化分析，通过CytoNCA 插件进行拓扑学分析，分别以度值（degree，表示某一节点与其他节点的连接性）、中间中心性（betweenness centrality，BC，表示经过某一节点的最短路径的数量）、接近中心性（closeness centrality，CC，表示某一节点与网络中其他节点的平均距离）的中位值为条件，筛选确定核心靶点。

1.5 交集靶点的基因本体（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将1.2 项下获得的交集靶点导入metascape 在线数据库（https://metascape.org/），进行GO 功能注释和KEGG 通路富集分析。其中，GO 富集分析通过3个维度来解释和注释基因，包括细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）分析；而KEGG通路富集主要进行路径分析。分析物种为“Human（智人）”，每条通路至少包含3 个基因，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.6 药物成分-核心靶点分子对接验证

利用Discovery Studio 2016软件对当归六黄汤关键活性成分与核心靶点的结合能力进行对接预测。当归六黄汤关键活性成分的.Mol2 格式文件和蛋白质的.PDB 格式文件分别从TCMSP 和PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载。导入后，将目标蛋白的所有晶体水分子清除，采用软件中的“prepare protein”模块对蛋白质受体进行去除原配体、水分子及添加氢原子等预处理并寻找活性口袋。对小分子配体进行能量最小化处理，并将小分子配体的所有柔性键设置为可旋转，应用软件中的CDOCKER功能对核心靶点蛋白受体和活性成分小分子配体进行分子对接。以目标蛋白与配体之间的氢键、静电相互作用、π-π 键或范德华力等各种键能来计算两者的结合能。结合能表示为负数，数值越高表示结合能力越强，结合越稳定。受体蛋白和小分子之间相互作用以2D结构表示。

2 结果

2.1 当归六黄汤活性成分和靶点筛选结果

通过TCMSP共检索到当归六黄汤主要活性化合物111 个，其中当归2 个、黄芪20 个、熟地黄2 个、黄芩36 个、黄连14 个、黄柏37 个。进一步得到活性成分对应的蛋白靶点，删除无对应蛋白靶点的活性成分。将蛋白靶点数据输入UniProt数据库进行比对和矫正，删除无对应靶点基因的靶蛋白，输出对应的靶点基因。与此同时，通过查阅文献[10]完善了生地黄的活性成分1个和靶点基因38个，共获得活性成分86个和对应靶点基因216个。活性成分见表1。

表1 当归六黄汤主要活性成分

续表1

续表1

2.2 PMS靶点及其与活性化合物交集靶点分析

获取PMS 相关的843 个靶点基因，将其与当归六黄汤活性化合物的216 个靶点基因一并导入微生信在线作图网站，绘制韦恩图，取交集得到活性成分与疾病交集靶点基因共52个（图1），这些基因被认为是当归六黄汤治疗PMS的潜在作用靶点。

图1 当归六黄汤药物靶点和PMS疾病靶点韦恩图

2.3 药物-活性成分-交集靶点网络构建

将活性成分和对应的交集靶点导入Cytoscape 3.7.1 软件建立药物-活性成分-交集靶点网络，该网络有126个节点、545条边（图2）。并采用软件中的NetworkAnalyzer 功能进行网络拓扑分析，筛选出5个关键活性成分，见表2。

表2 当归六黄汤治疗PMS度值和BC值均在前10的关键活性成分

图2 当归六黄汤治疗PMS的药物-活性成分-交集靶点网络

2.4 PPI网络构建及拓扑分析

将上述52 个交集靶点导入STRING 网站构建PPI网络，隐藏游离节点。将获得的PPI网络的.TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化分析，得到含51 个节点、670 条边的网络（图3A）。利用NetworkAnalyzer 对PPI 网络进行拓扑分析和计算后，进行第一轮筛选，取度值≥12、BC≥0.009、CC≥0.510 的靶点，得到含有20 个节点、232 条边的网络（图3B）。第二轮筛选取度值≥20、BC≥0.024、CC≥0.575 的靶点，得到含有5 个节点、20 条边的网络（图3C）。经过2 轮筛选最终得到5 个核心靶点，分别为白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素G/H 合酶2（PTGS2）、雌激素受体1（ESR1）、IL-1B 和糖皮质激素受体基因亚科3 C组成员1（NR3C1），见表3。

表3 当归六黄汤治疗PMS核心靶点

图3 当归六黄汤治疗PMS交集靶点PPI网络

2.5 交集靶点的GO功能注释和KEGG富集分析

对52个交集靶点的GO功能注释分析共得到800个条目（P＜0.05），包括BP 678 个、CC 37 个、MF 85 个。其中BP 主要涉及对异种刺激的反应、细胞对有机环状化合物的反应、对类固醇激素的反应、管径调节、异生物分解代谢过程、对脂多糖的反应等；CC 主要涉及膜筏、突触前膜的组成部分、转录调节复合物、受体复合物、细胞器外膜等；MF主要集中于α-肾上腺素能受体活性、核受体活性、雌激素2-羟化酶活性、细胞因子受体结合等，见图4A。

KEGG 富集分析主要集中在化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、癌症、神经活性配体-受体相互作用、流体剪切应力和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、雌激素信号通路、突触小泡循环、AMPK 信号通路等。KEGG 信号通路气泡图如图4B所示。结果提示，发挥抗炎和雌激素样协同作用，减少癌症和心血管并发症，可能是当归六黄汤治疗PMS的主要机制。

图4 当归六黄汤治疗PMS靶点的GO功能注释和KEGG通路富集分析

2.6 药物成分-核心靶点分子对接验证结果

将2.3项下所得关键活性成分和2.4项下所得的5 个核心靶点基因进行分子对接验证，并通过Discovery Studio 2016 计算配体与受体的结合能。结果显示当归六黄汤关键活性成分能够与不同核心靶点活性口袋中1 个或多个氨基酸残基结合，形成氢键、π-π 键或范德华力等，从而形成稳定的对接模式，各化合物与核心靶基因结合能见表4。选择结合能最低的构象（-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY 得分最好）对接结果进行2D 可视化展示（图5）。

图5 当归六黄汤治疗PMS活性化合物与核心靶点结合能最低的构象

表4 当归六黄汤治疗PMS活性化合物与核心靶基因结合能 kcal·mol-1

3 讨论

本研究采用网络药理学与分子对接相结合的方法，研究当归六黄汤治疗PMS 的潜在活性成分、靶点和作用机制。通过对当归、黄芪、熟地黄、生地黄、黄芩、黄连、黄柏化学成分分析，确定了当归六黄汤中关键活性成分可能为槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇。分子对接结果证明，这些化合物可以与大多数核心靶形成稳定的对接模式。槲皮素和山柰酚是黄酮醇类植物雌激素，其结构与雌二醇结构类似，可以结合雌激素受体并经其介导发挥作用，是很好的雌激素替代药物[11-12]。槲皮素和山柰酚还具有抗癌、抗炎、保护血管和神经元等生物活性[13-15]。豆甾醇和β-谷甾醇是常见的植物甾醇，被用于治疗各种炎症性疾病[16]，研究表明，豆甾醇对毒性诱导的神经元细胞具有很好的保护作用[17]。此外，β-谷甾醇还具有抗糖尿病、调血脂、抗癌等作用[18]。

对当归六黄汤和PMS的52个交集靶点基因进行PPI分析，筛选确定了当归六黄汤治疗PMS的5个核心靶基因，即IL-6、PTGS2、ESR1、IL-1B和NR3C1。研究表明，雌激素缺乏会引起女性外阴、阴道和膀胱尿道区域出现萎缩症状，50%以上的围绝经期女性受之困扰，临床上主要表现为生殖器刺激、干燥和灼热等炎性症状[19]。IL-6和IL-1B 是细胞因子，可介导炎性反应参与免疫细胞的形成［20-21］。PTGS2 是一种诱导型酶，在大多数细胞中不表达或少量表达，当细胞受到促炎细胞因子和癌症促进剂的刺激时，PTGS2 的表达上调并参与炎症和肿瘤的形成和发展[22]。ESR1基因编码雌激素受体α（ERα），可以结合槲皮素、山柰酚等植物雌激素发挥雌激素样作用[11]。据研究，NR3C1基因的甲基化水平与认知障碍有关[23]。

KEGG 富集分析主要集中在化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、癌症、神经活性配体-受体相互作用、流体剪切应力和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、雌激素信号通路、突触小泡循环、AMPK 信号通路等。临床研究显示，围绝经期女性是生殖系统恶性肿瘤的高发期[24]，当归六黄汤可能通过“化学致癌-受体激活”和“癌症”信号通路发挥抑制肿瘤的作用。心血管疾病是PMS 的远期并发症之一，随着女性趋于绝经年龄，雌激素缺乏导致机体组织中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性下调、NO合成受阻进而影响血管正常功能，这是促使冠心病、高血压等一系列心血管疾病发生发展的主要因素[19]。当归六黄汤可能通过脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化和AMPK 信号通路来防治PMS 患者的心血管疾病。PMS 患者绝大部分会伴有盗汗和精神神经症状。雌激素水平低下会导致植物神经功能紊乱和代谢障碍，从而引发盗汗症状[25]。同时低水平的雌激素还会致使中枢神经系统内单胺氧化酶的活性失于抑制，进而促进了中枢神经递质的降解，5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）等神经递质的合成受限，导致情绪障碍类症状的发生[26-27]。当归六黄汤可能通过雌激素信号通路、神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触、突触小泡循环信号通路发挥雌激素样作用，从而调控PMS 患者的盗汗和精神神经症状。研究发现，激活AMPK 信号通路可有效抑制IL-1B、IL-6 等促炎因子的分泌[28]，推测当归六黄汤可通过激活AMPK信号通路发挥抗炎作用。

4 结论

本研究采用网络药理学和分子对接分析了当归六黄汤治疗PMS 潜在活性成分、靶点和作用途径。共获取112 个有效活性成分，经筛选得到5 个关键活性成分，分别为槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚和7-O-甲基-异微凸剑叶莎醇，主要发挥抗炎和雌激素样作用；获取52 个交集靶点，并筛选得到5 个核心靶点，分别是IL-6、PTGS2、ESR1、IL-1B 和NR3C1，主要参与炎症反应和激素调节。KEGG 富集分析结果显示，当归六黄汤治疗PMS主要通过化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、癌症、神经活性配体-受体相互作用、流体剪切应力和动脉粥样硬化、5-羟色胺能突触、雌激素信号通路、突触小泡循环、AMPK 信号通路等发挥作用。同时，通过分子对接验证了当归六黄汤的关键活性成分可以与核心靶点蛋白形成稳定的对接模型。综上可知，当归六黄汤通过多成分、多靶点、多途径的作用机制治疗PMS，主要发挥抗炎和雌激素样协同作用。