《中华人民共和国药典》2020年版收载何首乌和制何首乌质量标准【鉴别】项的商榷△

王雪婷，杨建波，程显隆，汪祺，高慧宇，宋云飞，王莹，魏锋，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 100050

何首乌为《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版收载品种，为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThumb.的干燥块根，于秋、冬两季叶枯萎时采挖，削去两端，洗净，个大的切成块，干燥，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效[1]。制首乌为何首乌的炮制加工品，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊调脂的作用，临床可用于血虚萎黄、眩晕耳鸣、须发早白、腰膝酸软、肢体麻木、崩漏带下、高脂血症[1]。何首乌中主要的活性成分为2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、蒽醌（结合蒽醌和游离蒽醌）、黄酮、萘、酰胺等类成分，但是这些不同类型化合物极性差别较大[2-5]。《中国药典》2020 年版何首乌和制首乌项下【鉴别】项中的供试品溶液制备方式采用加热回流提取，操作复杂、费时费力；薄层鉴别方法采用三氯甲烷-甲醇为展开剂，毒性较大，展开后主斑点数较少，分离度相对较差，且需要二次展开，操作较为繁琐。为此，通过前期研究及文献报道[6-12]，本研究对何首乌和制何首乌的提取方式及薄层色谱鉴别方法进行改进，以超声提取代替加热回流制备样品，采用毒性较低的二氯甲烷-甲醇-甲酸系统代替三氯甲烷-甲醇系统，同时增加石油醚-乙酸乙酯-甲酸系统对极性较低的成分斑点进行鉴别，结果得到了优于《中国药典》2020年版何首乌【鉴别】项下方法的斑点和显色效果，有助于何首乌和制何首乌药品标准的进一步提高和优化。

1 材料

1.1 仪器

QUINTIX313-1CN 型万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；KQ-500DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率：40 kHz）；AST 4 型半自动薄层点样仪、ADC 2型全自动薄层色谱展开仪、Visualizer 型薄层数码成像系统（瑞士卡玛公司）；硅胶G60薄层板（德国Merck公司）。

1.2 试药

对照品2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批号：110844-201915，纯度：90.7%）、大黄素（批号：110756-201913，纯度：96.0%）、大黄素甲醚（批号：110758-201817，纯度：99.2%）、何首乌对照药材（批号：120934-201410）和制何首乌对照药材（批号：121454-201806）均购于中国食品药品检定研究院；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：23313-21-5，纯度：98%）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：23451-01-6，纯度：98%）均购于上海源叶生物科技有限公司；常规试剂为分析纯。

22 批生何首乌样品和34 批制何首乌样品均经中国食品药品检定研究院杨建波副研究员鉴定为何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根及其炮制品，样品信息见表1～2。

表1 何首乌样品信息

制何首乌样品Z1～Z18、Z34 为实验室自制：Z1～Z18 采用《中国药典》2020 年版通则（0213）[13]蒸法炮制加工，取何首乌片（批号：S8、S22）约1 kg，分别加入超纯水、黑豆汁670 mL，拌匀，静置过夜使汁吸尽，置木质蒸屉隔水加热，在2、4、8、12、18、24、30、36、48 h 分别取出一定量样品，晒干，分别得到清蒸（Z1～Z9）、拌入黑豆汁蒸（Z10～Z18）制何首乌样品。黑豆汁制法：取黑豆1 kg，加水适量，煮约4 h，熬汁约1.5 kg，豆渣再加水煮约3 h，熬汁约1 kg，合并得黑豆汁约2.5 kg。Z34为炖制何首乌，参照《中国药典》2020 年版通则（0213）炖法炮制，取何首乌（批号：S8）约1 kg，用黑豆汁拌匀，置非铁质的适宜容器内，炖至汁液吸尽，得到制何首乌样品[5]。

表2 制何首乌样品信息

Z19～Z20 参照《中国药典》 2020 年版通则（0213）方法，拌入黑豆汁炖制。

Z21～Z22 样品制法：辅料为黑豆汁（10%黑豆，首次煮4 h，再次煮3 h，合并2 次黑豆汁即得）；黑豆汁与何首乌块拌匀，润12 h；蒸箱蒸8 h，焖过夜（约14 h）；干燥7.5 h（敞开式烘箱，70 ℃）；蒸4 h（没有焖），晒干。

Z23～Z24 样品制法：将净何首乌200 kg 放到不锈钢盘，取黑豆20 kg，加水适量，煮约4 h，熬汁约20 kg，合并得黑豆汁约45 kg，然后倒入黑豆汁和何首乌搅拌均匀，焖润12 h 即可。将完全润透的何首乌放入蒸药机，蒸制时间10 h，温度100 ℃，蒸制5 h后取样观察色泽情况（由红褐色部分变成黑褐色或棕褐色，取样检测指标成分含量变化），待蒸制10 h后，表面由红褐色全部变成黑褐色或棕褐色，取样检测指标成分含量变化。

Z25～Z26 样品制法：照《中国药典》2020 年版通则（0213）[13]蒸法，黑豆3 kg，加水80 L 煎煮8 h（煎煮2次，第1次煎煮后浸泡过夜）。煎煮液加何首乌18 kg，浸润22 h，蒸16 h，中间品蒸制8 h。干燥即得。

Z27～Z28 样品制法：依据《中国药典》2020 年版（一部），取何首乌块100 kg、黑豆汁25 kg，拌匀上锅蒸4 h，倒出翻蒸，上锅再蒸3 h，取出、合并汁液，干燥。

Z29样品制法：高压蒸制。

Z30 样品制法：原料净制，洗药机洗至无泥沙，浸泡2 h，焖润2～3 h；切至厚度为8～12 mm；温度100 ℃，蒸4～6 h，至呈棕褐色，焖2 h；干燥温度50～60 ℃，时间2～3 h，至水分不超过12%。

Z31～Z33 样品制法：按照《中国药典》2020 年版的工艺要求，用清蒸法，没有加任何辅料。

2 方法与结果

2.1 《中国药典》2020 年版何首乌【鉴别】（2）项下提取方式的优化

2.1.1 对照品溶液的配制 取大黄素、大黄素甲醚、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg·mL-1的溶液。

2.1.2 供试品溶液的配制

2.1.2.1 《中国药典》2020 年版制备方法 分别取何首乌药材（S5、S8、S15、S16 和S19）和何首乌对照药材，按《中国药典》2020年版何首乌【鉴别】（2）项下供试品溶液制备方法，分别得到供试品溶液（HS5、HS8、HS15、HS16 和HS19）和对照药材溶液（DZYC-H1）。

2.1.2.2 改进方法 分别取何首乌药材（S5、S8、S15、S16 和S19）粉末0.25 g，分别置具塞锥形瓶中，加乙醇50 mL，超声20 min（功率：300 W，频率：40 kHz），滤过，滤液浓缩至3 mL 作为供试品溶液（CS5、CS8、CS15、CS16 和CS19）。另取何首乌对照药材0.25 g，同法制成对照药材溶液（DZYC-C1）。

2.1.3 薄层色谱测定 按照《中国药典》2020 年版薄层色谱法（通则0502），吸取2.1.2 项下2 种供试品溶液制备方法制得的溶液各2 μL，大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品各0.5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上使成条状，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）为展开剂，展开至约3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）为展开剂，展开至约7 cm，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。薄层色谱图见图1。结果发现，通过2种制备方式制得的样品在相同的展开条件下展开结果并没有明显差异，因此可以用操作更加简单方便的超声提取代替加热回流作为样品制备方式。

图1 不同制备方法何首乌供试品薄层色谱考察

2.2 《中国药典》2020 年版何首乌【鉴别】（2）项下展开系统的优化

2.2.1 对照品及供试品溶液制备 分别按照2.1.1、2.1.2.2 项下方法制备对照品及供试品溶液。点样量分别为供试品和大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷各2 μL，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚各0.5 μL，大黄素1 μL。

2.2.2 薄层色谱测定 采用3 种不同薄层色谱展开系统：1）按《中国药典》2020 年版方法，以三氯甲烷-甲醇（7∶3）为展开剂，展开至约3.5 cm，取出，晾干，再以三氯甲烷-甲醇（20∶1）为展开剂，展开至约7 cm，取出，晾干。2）以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）为展开剂展开，取出，晾干。3）以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）为展开剂展开，取出，晾干，其余条件按照2.1.3 项下方法。结果见图2～4。展开后发现，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）为展开剂，对于何首乌中的不同极性的化合物都有较好的展开效果，相较于三氯甲烷-甲醇系统，展开后斑点明显增多。

图2 何首乌样品按展开系统（1）展开结果

图3 何首乌样品按展开系统（2）展开结果

图4 何首乌样品按展开系统（3）展开结果

2.3 检视条件考察

2.3.1 对照品及供试品溶液制备 分别按照2.1.1、2.1.2.2项下方法制备对照品及供试品溶液。

2.3.2 薄层色谱测定 采用改进后的2 种展开系统（2）和（3），以硅胶G板展开晾干后，分别考察喷与不喷10%硫酸乙醇显色剂时，在日光灯和紫外灯（365 nm）下的斑点情况，结果见图5～6。由石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）和二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）展开系统展开后喷以10%硫酸乙醇显色剂并在紫外灯365 nm下检视，斑点更为丰富和清晰。

图5 何首乌样品展开系统（2）在日光灯和紫外光灯下检视结果

2.4 薄层色谱鉴别方法的确定

图6 何首乌样品展开系统（3）在日光灯和紫外光灯下检视结果

基于供试品制备方式、展开体系和检视条件的考察，确定改进后的薄层鉴别方法：1）取何首乌粉末0.25 g，按2.1.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下方法制备大黄素和大黄素甲醚对照品溶液，照薄层色谱法（通则0502），吸取供试品溶液和对照药材溶液各2 μL，大黄素甲醚对照品溶液0.5 μL，大黄素对照品溶液0.1 μL，分别点于同一以羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上使成条状。以石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇显色剂后，置紫外光灯（365 mn）下检视。2）取何首乌粉末0.25 g，按2.1.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下方法制备2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液和对照药材溶液各2 μL，大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液2 μL，2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷各0.5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶G 薄层板上使成条状。以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）为展开剂，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇显色剂，置紫外光灯（365 mn）下检视。

3 何首乌和制何首乌样品鉴别

3.1 何首乌样品鉴别

取何首乌样品（S1～S22），按2.4 项下薄层色谱鉴别方法，分别使用（1）和（2）条件进行薄层色谱鉴定，结果见图7～8。

图7 何首乌样品按【鉴别】条件（1）检测结果

图8 何首乌样品按【鉴别】条件（2）检测结果

3.2 制何首乌样品鉴别

取制何首乌样品（Z1～Z34），按2.4 项下薄层色谱鉴别方法，分别使用（1）和（2）条件进行薄层色谱鉴定，结果见图9～10。

图9 制何首乌样品按【鉴别】条件（1）检测结果

4 讨论

本研究共收集56 份样品，其中生何首乌22 批，制首乌34 批。不同批次生何首乌药材薄层检视结果显示，除贵州铜仁产何首乌外，其他所有产地何首乌药材与对照药材相比，主要成分斑点并无明显差异，说明何首乌样品的一致性较好。根据文献报道，何首乌中以大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为主的结合蒽醌具有潜在的肝毒性[14-16]。不同炮制工艺及不同炮制时间制首乌样品薄层检视结果显示，随炮制时间延长，制首乌中结合蒽醌含量显著下降，可能达到炮制减毒的效果，与本课题组前期对制何首乌中蒽醌类成分含量测定结果基本一致[5]。通过对黑豆蒸与清蒸工艺的考察，发现何首乌经过36 h 的炮制后，结合蒽醌的含量大幅下降，且在薄层色谱鉴别中，基本观察不到明显的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等结合蒽醌的主斑点，同制何首乌对照药材溶液的薄层色谱图基本一致。然而，本研究所收集的16 批制首乌样品薄层检视结果显示，大部分样品都有明显的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等结合蒽醌斑点，推测其炮制时间不足，与实验结果基本一致。

图10 制何首乌样品按【鉴别】条件（2）检测结果

对于《中国药典》2020 年版何首乌和制何首乌【鉴别】（2）收载的供试品提取方式，本研究尝试以超声提取替代原来的加热回流提取，结果发现两者薄层展开结果没有明显区别，因此选用更加简便的超声提取作为供试品制备方式。与此同时，对于【鉴别】（2）收载的展开系统，用低毒、易得的石油醚-乙酸乙酯-甲酸及二氯甲烷-甲醇-甲酸代替三氯甲烷-甲醇系统，所获得的薄层色谱图较《中国药典》2020 年版何首乌和制何首乌项下薄层色谱条件更理想。因此，《中国药典》2020 年版生和制何首乌【鉴别】（2）可采用超声提取来替代加热回流提取；采用石油醚-乙酸乙酯-甲酸（5∶1∶0.3）为展开系统来鉴别生和制何首乌中大黄素和大黄素甲醚等游离蒽醌，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（5∶1∶0.3）为展开系统来鉴别生和制何首乌中大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等结合蒽醌及2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。改进后的2 种薄层色谱鉴别方法对何首乌中主要成分2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蒽醌类成分（游离蒽醌及结合蒽醌）均具有较好的展开效果，斑点清晰，且分离度较好，可有效用于生（制）何首乌药材和饮片的鉴别。