黄芩素通过TLR4/NF-κB信号通路对小鼠结肠炎的干预作用

邵晓晓，王伟中，马国龙，金颖莉，史睿昕，蒋益

1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 消化内科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）确切病因未知[1]，临床上缺乏特异性、有效的治疗药物。UC患者病情常迁延反复，因此寻找安全有效的治疗药物迫在眉睫。研究证实核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）在UC患者体内呈过度活化状态，参与UC的发生和发展[2]。Toll样受体4（Tolllike receptor 4,TLR4）通过外来刺激因子和TLR4结合之后激活固有免疫系统，启动NF-κB信号通路，导致炎症反应发生[3]。

黄芩素（分子式C15H10O5）是中药黄芩的主要有效成分，具有抗炎、抗菌、免疫调节等作用[4]。《伤寒论》认为以黄芩为主药的黄芩汤有清热燥湿、和中止痛的作用，近年来研究发现，黄芩汤对治疗炎症性肠病具有较好疗效，但机制不明[5]。研究还发现黄芩素能够通过调节NF-κB的活性达到抗炎效果[6]。因此，本研究通过观察黄芩素对葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的实验性结肠炎小鼠的治疗作用，研究黄芩素是否通过干预TLR4/NF-κB信号通路发挥作用，旨在为黄芩素治疗UC提供实验和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：黄芩素购自上海Aladdin公司，DSS（相对分子质量36～50 kDa）购自美国MP Biomedicals公司，羟甲基纤维素钠、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒、二脒基苯基吲哚（DAPI）染料购自北京Solarbio公司，RNAsimple总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，PrimeScript反转录试剂盒购自美国Roche公司，iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix购自美国Bio-Rad公司。山羊抗小鼠NF-κB p65抗体购自上海Rndsystems公司、兔抗小鼠EPCAm抗体购自美国Affinity公司，驴抗山羊（Alexa Fluor488标记）荧光二抗购自英国Abcam公司，驴抗兔（Cy3标记）荧光二抗购自武汉Servicebio公司。

1.1.2 动物：6～8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量18～22（21.7±0.16）g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，并在温州医科大学SPF级实验动物中心适应性饲养1周后用于实验，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2018-0017。小鼠饲养具体环境条件如下：温度22～25 ℃，相对湿度45%，光照和黑暗环境各12 h循环。本动物实验研究获温州医科大学实验动物伦理委员会批准（编号wydw2017-0019）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：将C57BL/6品系小鼠按照随机数字表法分为5组，即对照组、结肠炎组、黄芩素低剂量（Ba-L）治疗组[10 mg/（kg·d）]、黄芩素高剂量（Ba-H）治疗组[25 mg/（kg·d）]和5-氨基水杨酸（5-amino-salicylic acid,5-ASA）治疗组，每组各12 只。对照组小鼠自由饮用清水，其余小鼠连续7 d自由饮用3.5% DSS溶液，构建实验性结肠炎模型。药物剂量和给药方式参照ZHONG等[7]的方法：在开始饮用DSS溶液7 d前予实验组小鼠药物（黄芩素或5-ASA）灌胃连续7 d，在开始饮用DSS溶液后，继续给予药物（黄芩素或5-ASA）灌胃7 d，每日灌胃1次，每次0.2 mL。所有药物均溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中制成混悬液，对照组小鼠连续14 d每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠溶液0.2 mL。造模后定期观测、记录小鼠的体质量变化、粪便性状和便血等情况，并评估小鼠疾病活动指数（disease activity index,DAI）[8]。在造模第7天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集小鼠结肠组织并测量结肠长度，选取距离小鼠肛门1～2 cm处的结肠组织，予以常规组织脱水、石蜡包埋。组织连续切片后予以HE染色，采用组织学活动度评分（histology activity index,HAI）[9]对结肠组织进行病理学评估炎症程度和组织损伤。

1.2.2 实时荧光定量PCR：检测小鼠结肠组织中炎症细胞因子[γ干扰素（interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β,IL-1β）]的水平，反映小鼠肠道炎症的程度。检测小鼠结肠组织中TLR4、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）、NF-κB p65的相对表达水平，间接反映TLR4/NF-κB信号通路的激活程度。根据RNAsimple总RNA提取试剂盒说明书从小鼠结肠组织中提取总RNA，采用分光光度计检测RNA浓度、纯度，根据PrimeScript反转录试剂盒说明书制备cDNA样品，采用iTaqTMUniversal SYBR®Green Supermix定量PCR检测。总反应体系10 μL，包括上下游引物各0.4 μL，SYBR Green 5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.2 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 个循环。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，见表1。以标准管家基因（GAPDH）为参照，采用2-ΔΔCT法计算目的基因mRNA的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR采用的引物序列

1.2.3 免疫荧光技术检测肠上皮细胞NF-κB p65入核率：检测小鼠结肠上皮细胞中NF-κB p65的入核率，评价NF-κB信号通路的激活程度。小鼠结肠组织石蜡切片，经过脱蜡、水化之后，枸橼酸钠抗原热修复，用0.3% Triton X-100破膜15 min。PBS洗涤后，用3% BSA封闭1 h，滴加一抗（山羊抗小鼠NF-κB p65抗体和兔抗小鼠EPCAm抗体），置于湿盒中4 ℃孵育过夜。次日，PBS洗涤后，滴加荧光二抗[驴抗山羊（Alexa Fluor 488 标记）荧光二抗和驴抗兔（Cy3标记）荧光二抗]，室温避光孵育1 h后，用DAPI复染细胞核。PBS洗涤，滴加自发荧光淬灭剂，予以抗荧光淬灭封片剂封片，将切片放置于荧光显微镜下观测并采集相应图像。采用Image Pro Plus 6.0（IPP）图像分析软件对所得图像进行定量分析。DAPI染色标记细胞核，EPCAm抗体标记小鼠结肠上皮细胞，NF-κB p65抗体标记p65蛋白，在高倍镜视野下，统计肠上皮细胞中p65的入核率。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS26.0统计处理软件分析数据。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey检验（方差齐）或Tamhane’s T2检验（方差不齐）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠结肠炎严重程度评估 在整个实验过程中，对照组小鼠无腹泻和便血等症状，总体精神状态良好，体质量轻微上升；其余4组小鼠均在饮用3.5% DSS溶液后的第3天开始出现体质量下降、腹泻、便血等表现。在第7天时，结肠炎组小鼠体质量和小鼠结肠长度都明显低于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01）；而Ba-L治疗组、Ba-H治疗组以及5-ASA治疗组小鼠体质量和结肠长度均明显高于结肠炎组，差异有统计学意义（均P＜0.01），见图1。各治疗组小鼠体质量变化率差异无统计学意义（均P＞0.05）；而Ba-L治疗组小鼠结肠长度显著短于5-ASA治疗组，差异有统计学意义（P＜0.01）。造模第7天时，Ba-L治疗组、Ba-H治疗组以及5-ASA治疗组小鼠DAI均显著低于结肠炎组小鼠，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图1；HAI评分均显著低于结肠炎组，差异有统计学意义（均P＜0.01）；光镜下表现为隐窝结构更加完整，黏膜溃疡面积更小，炎性细胞浸润更少，见图2、图3。

2.2 小鼠炎性细胞因子相关mRNA相对表达水平结肠炎组小鼠的结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平明显高于对照组小鼠，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。Ba-H治疗组结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平显著低于结肠炎组小鼠，差异有统计学意义（均P＜0.01）。3个治疗组间比较，这些炎性细胞因子mRNA表达水平差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

2.3 TLR4/NF-κB信号通路相关mRNA相对表达水平结肠炎组小鼠结肠组织中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.01）。Ba-L治疗组、Ba-H治疗组和5-ASA治疗组小鼠结肠组织中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于结肠炎组，差异有统计学意义（均P＜0.05）；各治疗组之间上述指标表达差异无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

表2 各组小鼠结肠组织mRNA相对表达量（每组n=12，）

表2 各组小鼠结肠组织mRNA相对表达量（每组n=12，）

与对照组比：aP ＜0.01；与结肠炎组比：bP ＜0.05，cP ＜0.01

2.4 免疫荧光检测肠上皮细胞中NF-κB p65的入核率 结肠炎组肠上皮细胞中NF-κB p65的入核率显著高于对照组小鼠，差异有统计学意义（P＜0.01）。Ba-L治疗组、Ba-H治疗组以及5-ASA治疗组的肠上皮细胞中NF-κB p65的入核率均显著低于结肠炎组，差异有统计学意义（均P＜0.01），见图4。

3 讨论

西医理论认为UC是遗传、免疫、环境、微生物等因素综合作用于遗传易感者，使机体产生异常免疫反应，最终导致肠组织炎症性损伤[10]。祖国传统医学将UC归属于“赤沃”“泄泻”“久痢”等疾病范畴[11]。目前UC仍缺乏特异性治疗药物，而祖国传统医药对于治疗胃肠道慢性疾病常显示出独到的疗效。现代药理学研究表明，提取自中药黄芩的黄芩素具有抗感染、调节免疫等药理作用，参与调节多种炎症信号通路，兼具高效、无毒、经济等优点，有望成为治疗UC的潜在药物。

本研究发现小鼠饮用3.5%的DSS溶液后会出现明显的急性结肠炎表现，如严重的腹泻、便血、体质量下降、结肠短缩等，这与既往的报道基本相符[8]。5-ASA作为经典的UC治疗药物，被多项动物研究用于治疗DSS诱导的急性结肠炎，并具备一定的疗效。本研究发现，口服黄芩素和5-ASA能够显著改善结肠炎小鼠的肠道炎症，增加小鼠体质量及结肠长度，降低DAI和HAI评分。本研究还发现，结肠炎组小鼠较对照组结肠黏膜结构破坏严重，出现的肠道溃疡更大，炎性细胞浸润数目更多、程度更深、范围更广，且结肠炎组小鼠的结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β及MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA表达水平明显高于对照组小鼠。本研究还发现Ba-H治疗组结肠组织中IFN-γ、TNF-α、IL-1β的mRNA表达水平显著低于结肠炎组小鼠，且Ba-L治疗组、Ba-H治疗组和5-ASA治疗组小鼠结肠组织中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平亦均低于结肠炎组，但Ba-L治疗组、Ba-H治疗组和5-ASA治疗组间上述炎性细胞因子和TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白的mRNA表达水平差异无统计学意义。上述研究结果提示黄芩素和经典药物5-ASA在该模型中显示出相似的治疗效果，各治疗组间DAI、HAI以及结肠炎症细胞因子水平差异均无统计学意义。

在UC的发病过程中，肠上皮细胞和单核巨噬细胞中异常激活的TLR4/NF-κB信号是重要的炎症启动因素，会导致大量炎症细胞因子的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等，最终引起不可逆的肠道炎症反应[12]。多项研究发现，黄芩素可通过抑制NF-κB信号在多种炎症性疾病中发挥作用。WANG等[13]研究发现黄芩素可以通过抑制NF-κB信号通路抑制炎症反应进程，在阻塞性肾病过程中发挥抗纤维化效应。研究还发现，黄芩素可能通过抑制NF-κB信号通路缓解小鼠肠缺血/再灌注导致的急性肺损伤[14]。黄芩素还可能抑制哮喘的免疫-过敏-炎症反应而有望成为治疗哮喘的新型候选药物[15]。此外，HE等[16]发现黄芩素能通过抑制NF-κB活化缓解脂多糖诱导的急性乳腺炎。本研究不仅发现各治疗组小鼠结肠组织中MyD88、NF-κB p65、TLR4的mRNA水平均低于结肠炎组，而且进一步研究发现结肠炎组小鼠结肠组织中肠上皮细胞中NF-κB的入核率均高于对照组，5-ASA治疗组、Ba-L治疗组及Ba-H治疗组的结肠组织中肠上皮细胞中NF-κB的入核率均低于结肠炎组。目前黄芩素对于结肠炎的治疗作用也开始逐渐受到重视。李敏瑶等[17]研究提示黄芩汤中的黄酮类化合物可能通过调节炎症通路在UC治疗中发挥重要作用。王继森等[18]在研究黄芩汤对UC大鼠的作用中发现其有效成分通过降低细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平抑制实验性结肠炎大鼠的肠道炎症。研究还发现黄芩素不仅可以修复结肠炎小鼠的结肠组织黏膜屏障，还可以通过抑制NF-κB的活性，下调炎症因子的表达而达到抗炎效应[19]。

本研究结果和上述学者的研究共同提示，黄芩素可能通过TLR4/NF-κB信号通路抑制小鼠结肠炎。

本研究发现，黄芩素可能通过TLR4/NF-κB信号通路抑制DSS诱导的结肠炎症。本研究中黄芩素在对小鼠的治疗中发挥显著的抑炎作用，并且黄芩素相较于传统的5-ASA制剂具有安全、无毒等优势，未来可能在UC的临床治疗中发挥潜在的应用价值。