活血解毒中药有效成分以MAPK家族为靶点干预动脉粥样硬化的研究进展

张 艳，周庆兵，2，李丹丹，张 瑶，3，徐凤芹，2

心脑血管疾病的发生率及致残、致死人数逐渐升高，严重威胁着人民群众的健康安全。其中动脉粥样硬化是冠心病、脑梗死等众多心脑血管疾病的病理基础[1]，其病理过程涉及血脂浸润、慢性炎性、内皮损伤、平滑肌增殖等[2-3]。随着CANTOS研究的成功，动脉粥样硬化抗炎治疗地位更为突出[4]。在炎症背景下，针对丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)炎症信号的治疗可以作为干预动脉粥样硬化进展的潜在策略。MAPK信号通路主要包括3个分支，其中细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)参与调控细胞增殖和分化，Jun N-末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)和p38激酶同工酶介导炎症、应激和细胞凋亡。同时MAPK信号通路级联反应参与动脉粥样硬化的多种机制。

中医学认为动脉易损斑块破裂引起血栓、炎症反应等形成急性心血管事件的病理特点与毒邪骤发性、火热性等特点相契合。基于此，以陈可冀院士为主的科研团队提出了“瘀毒致变”学说，使活血解毒方药广泛应用于动脉粥样硬化的防治中。根据《中国药典》2015年版，活血解毒中药丹参、虎杖、川芎、栀子等及其活性成分可用于治疗动脉粥样硬化。活血解毒中药有效成分干预MAPK与动脉粥样硬化的研究日益增多，基于此，本研究深入分析活血解毒中药的有效成分，探讨其靶向调节MAPK参与动脉粥样硬化形成的作用机制。

1 脂质浸润

高血脂作为动脉粥样硬化的独立危险因素，对斑块的形成起着基础性作用。近年来，植物源降脂药越来越受关注，其中小檗碱(berberine)是目前报道最多的天然植物药。与他汀抗羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降脂途径不同，小檗碱通过激活ERK1/2，稳定低密度脂蛋白受体(LDL-R)mRNA的表达，导致血清低密度脂蛋白(LDL)降低，可作为降脂新途径[5]。此外，荟萃分析也发现，小檗碱可以改善血脂异常病人的脂质状态[6]。川芎嗪(ligustrazine)是从川芎根茎中提取的生物碱成分。Duan等[7]对RAW264.7巨噬细胞和载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠主动脉斑块的研究发现，川芎嗪可明显增加胆固醇外流，抑制氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的吸收，从而改善巨噬细胞脂质积累；川芎嗪通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)和p38 MAPK信号下调清道夫受体，上调三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运体A1(ABCA1)，从而抑制巨噬细胞的脂质积累。体内和体外实验结果一致，进一步证实了川芎嗪对脂质积累的抑制作用。栀子苷(geniposide)主要来源于中药栀子，为环烯醚萜类成分。在体内，栀子苷可以抑制西方饮食ApoE-/-小鼠总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。在体外，栀子苷通过调节与p38 MAPK和Akt信号通路相关的细胞膜中多种脂质转运[下调清道夫受体抗体(SR-A)及上调ABCA1或清道夫受体B1(SRB1) mRNA和蛋白水平]的表达平衡，发挥抗动脉粥样硬化且抑制溶血磷脂酸(LPA)诱导泡沫细胞形成[8]。在体内，番红花酸(crocetin)通过抗氧化、抑制炎症反应和p38 MAPK信号通路等途径对高胆固醇饮食致动脉粥样硬化Wistar大鼠产生降脂作用[9]。此外，丹参酮ⅡA也显示出降脂潜力[10]。

2 内皮损伤

在血脂异常、炎性因子等危险因素刺激下，LDL-C进入受损血管内皮被氧化修饰为ox-LDL，加速血管内皮的损伤，使得第一道防线被破坏。

2.1 内皮细胞促炎活动激活 川芎嗪可以抑制脂多糖(LPS)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中白细胞介素-8(IL-8)的表达，其机制可能是与阻断ERK、p38和核转录因子-κB(NF-κB)信号通路有关[11]。丹参属于活血化瘀中药，其主要脂溶性成分丹参酮ⅡA、隐丹参酮(cryptotanshinone)参与了抗动脉粥样硬化各个环节[12]。丹参酮ⅡA通过抑制MAPK通路，阻止晚期糖基化终产物和活性氧(ROS)的积累，从而抑制甲基乙二醛(MGO)诱导的上皮损伤[13]。白藜芦醇(resveratrol)来源于中药虎杖，是一种多酚类化合物。白藜芦醇通过抑制内皮细胞ERK/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)-Thr495改善低剪切应力诱导的氧化应激[14]。此外，白藜芦醇通过促进sirtuin-1诱导的NF-κB和p38 MAPK抑制作用，保护人脐静脉内皮细胞抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的损伤[15]。宋蕊等[16]研究表明，白藜芦醇通过抑制MAPK及NF-κB信号通路的激活，从而降低动脉粥样硬化家兔血清炎性因子水平白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α。此外，王不留行黄酮苷通过抑制ROS/p38 MAPK，抑制ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞间质化、炎症和细胞凋亡，实现体内外抗动脉粥样硬化的作用[17-18]。黄芩苷、汉黄芩素(wogonin)均来源于中药黄芩，为黄酮类化合物。在体内黄芩苷抑制NF-κB和p38 MAPK信号通路，通过抗炎、降脂、抗氧化抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化[19]。丹参酮ⅡA对ApoE-/-小鼠的干预研究表明，丹参酮主要通过调控竞争性内源RNA(ceRNA)网络，参与Ras、Rap1、MAPK、环磷酸腺苷(cAMP)等炎症信号通路的基因来干预动脉粥样硬化[20]；可能通过调控TNF-α/p38MAPK/NF-κB/视黄醇结合蛋白4(RBP4)信号通路，发挥调脂及抗炎(TNF-α、RBP4)作用[10]。此外，其他一系列化合物也通过此机制对内皮损伤表现出抗炎作用[21-23]。

2.2 内皮细胞凋亡 内皮细胞在不同因素(如ox-LDL、炎性因子)刺激下发生凋亡。血管内皮细胞凋亡导致内皮完整性丧失，促进动脉粥样硬化的发展[24]。

在体外，小檗碱通过阻断JNK介导的信号通路，增加髓样细胞白血病因子-1(MCL-1)表达和超氧化物歧化酶(SOD)活性，减轻炎性因子的刺激，保护人脐静脉内皮细胞免受脂多糖诱导的凋亡[25]。此外，小檗碱可通过下调p38 MAPK和NF-κB信号通路，降低细胞炎性因子IL-6、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17A(IL-17A)、TNF-α表达和心肌细胞凋亡[26]。丹皮酚(paeonol)是从牡丹皮等中药中分离得到的活性化合物。丹皮酚通过激活低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)/p38 MAPK/NF-κB通路抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[27]。

3 巨噬细胞

巨噬细胞在动脉粥样硬化形成过程中起着承上启下的作用，通过清道夫受体吞噬ox-LDL转化为泡沫细胞，形成动脉粥样硬化最早的脂质条纹，同时可分泌多种生长因子[血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤细胞生长因子(FGF)]和促炎因子[TNF-α、白细胞介素-1(IL-1)]。许多药用植物通过影响巨噬细胞的行为来实现抗动脉粥样硬化作用，如抑制泡沫细胞形成、抑制巨噬细胞炎症、调节巨噬细胞极化等。

3.1 抑制巨噬细胞炎症 隐丹参酮通过抑制NF-κB和MAPK信号通路，抑制RAW264.7巨噬细胞炎性细胞因子(TNF-α、IL-6)的分泌[28]。趋化因子配体-20(CCL-20)作为一种趋化因子，在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用。丹参酚酸A(salvianolic acid A)是从中药丹参中提取的水溶性生物活性化合物，可通过抑制p38 MAPK减轻TNF-α诱导的巨噬细胞及ApoE-/-小鼠中动脉粥样硬化斑块趋化因子配体-20的产生，达到抗动脉粥样硬化及降脂作用[29]。

3.2 抑制泡沫细胞形成 巨噬细胞源性泡沫细胞促进动脉粥样硬化形成最早的脂质条纹，是动脉粥样硬化最典型特征。一系列化合物通过抑制泡沫细胞形成及脂质吸收来抑制动脉粥样硬化。穿心莲内酯(andrographolide)属于二萜内酯类活性成分，在体内，穿心莲内酯通过抑制p38 MAPK、ERK1/2和NF-κB信号通路，从而抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞形成泡沫细胞[30]。姜黄素(curcumin)是来源于姜黄根茎中的一种多酚类化合物，也可见于郁金、莪术等活血解毒药物。姜黄素通过抑制p38 MAPK磷酸化，从而抑制ox-LDL诱导的CD36表达和泡沫细胞的形成[31]。栀子苷具有抗溶血磷脂酸诱导巨噬细胞形成泡沫细胞的作用。另外，栀子苷能通过MAPK、p38 MAPK和NF-κB信号通路明显抑制巨噬细胞泡沫形成、脂质转运和促炎细胞因子表达[8，32]。此外，红景天甙也有抑制泡沫细胞形成作用[33]。

3.3 巨噬细胞极化 巨噬细胞主要分为M1、M2巨噬细胞两种亚型。M1巨噬细胞与Th1细胞交流，分泌基质金属蛋白酶促进胶原分解，削弱纤维帽。相反的，M2巨噬细胞分泌抗炎因子抵消M1巨噬细胞的促炎作用，同时分泌促纤维生长因子，维持斑块稳定[34]。

在体内，栀子苷通过FOS/MAPK信号通路，分别抑制M1型巨噬细胞和促进M2型巨噬细胞极化，从而抑制和稳定新西兰兔动脉粥样硬化斑块的发展进程[35]。姜黄素也有抑制M1型巨噬细胞极化的作用[36]。

3.4 抑制巨噬细胞凋亡 Guo等[37]研究表明，在RAW264.7巨噬细胞中，白藜芦醇通过减少ROS生成、LOX-1和下调p38 MAPK通路来抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡[37]。在体外，黄芩苷通过剂量依赖性增强p38和JNK磷酸化的表达促进乙酰低密度脂蛋白(acetylate low-densitylipoprotein，AcLDL)和脂多糖诱导的巨噬细胞凋亡[38-39]。

3.5 维持斑块稳定 姜黄素有降脂、抗炎、稳定斑块、抗氧化及抗巨噬细胞极化等药理作用[33]。姜黄素通过抑制丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)或ox-LDL诱导的巨噬细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/MAPKs和蛋白激酶C(PKC)信号通路的激活，减轻基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶诱导剂(EMMPRIN)表达，以维持斑块稳定[40-41]。黄连素、水蛭提取物也有上述类似作用[42-43]。

4 血管平滑肌细胞(VSMC)

VSMC是血管中重要的细胞组成，在动脉粥样硬化早期，VSMCs具有较强的活化增殖能力，对防止斑块破裂具有重要的保护作用；然而，由于斑块中脂质的大量积累以及多种促炎因子生成，使得VSMC被ox-LDL激活，导致VSMC由“收缩”表型转化为“合成”表型，这可能是促进炎症反应和斑块坏死的核心[44]。MAPK家族3个核心成员ERK、p38 MAPK、JNK与细胞增殖、迁移及血管重构密切相关[45-46]。因此，靶向MAPK家族的植物源化合物是一种潜在的预防血管平滑肌细胞异常增殖和迁移的治疗策略。

川芎嗪通过抑制ROS的过量产生和p38 MAPK/JNK/ERK的磷酸化，对高糖诱导的血管平滑肌细胞损伤具有保护作用[47]。此外，有研究表明，川芎嗪可通过抑制ERK和P38 MAPK信号通路的激活，逆转血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导的增殖表型，部分下调血小板源生长因子诱导的VSMC的增殖和迁移[48]。穿心莲内酯以浓度依赖性的方式抑制血小板源生长因子诱导的VSMC增殖，同时降低ERK1/2和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达[49]。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)具有抗炎、抗凋亡、抗氧化应激的作用[50]。Jiang等[51]研究认为以TNF-α诱导VSMC可大量产生ROS，抑制血红素加氧酶-1产生，并通过提升ERK1/2蛋白磷酸化水平、激活MAPK信号通路而诱导VSMC增殖和迁移。栀子苷、丹参酮ⅡA均通过诱导血红素加氧酶-1的表达、ERK/MAPK和Akt通路的激活以及ROS的产生来抑制TNF-α诱导的VSMC的迁移和增殖[51]。Li等[52]研究发现，丹参酮ⅡA通过抑制MAPK信号通路和下调c-FOS表达，抑制VSMC增殖和减少内膜增生。除此之外，其他一些活性成分，如丹皮酚[53]、白藜芦醇[54]、汉黄芩素[55]等也通过靶向MAPK信号通路调控平滑肌细胞迁移与增殖。

5 血栓形成

在管腔局部狭窄等血流动力学发生变化的情况下，血小板活化，在管腔黏附、聚集形成附壁血栓。活化的血小板又进一步释放细胞因子，促进VSMC的增殖，形成串联，加重动脉粥样硬化的发生发展。

Lu等[56]研究表明，穿心莲内酯通过激活eNOS-NO/cGMP通路，抑制PI3K/Akt/p38 MAPK和PLCγ2-PKC级联，具有较强的抗血小板聚集活性。

6 其他相关新机制

6.1 表观遗传学 表观遗传学包括DNA甲基化、乙酰化及RNA甲基化等内容。最近，有研究通过DNA甲基化微阵列检测发现动脉粥样硬化病人主动脉斑块内存在异常甲基化基因，经京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析发现主要涉及MAPK通路[57]。Zhou等[58]研究表明，栀子川芎胶囊可调节动脉粥样硬化家兔异常甲基化基因(PRKCE、CACNB2、PRKCA等)也涉及MAPK信号通路。此外，栀子苷通过调控MAPK信号通路涉及基因甲基化水平，降低巨噬细胞泡沫化[59]。丹参酮ⅡA对ApoE-/-小鼠的非编码RNA(ncRNA)表达谱分析表明，主要参与MAPK等炎症通路，通过调节炎症反应来影响ncRNA的表达[20]。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是存在于多种RNA中的化学修饰方式。随着基因检测技术的发展，m6A研究主要集中在肿瘤领域。有研究发现m6A与动脉粥样硬化密切相关[60-61]，但目前在此领域研究还比较欠缺。未来，中医药可以在此领域深入研究。

6.2 肠道菌群 肠道菌群参与机体代谢及免疫过程，心血管疾病与肠道菌群紧密联系。目前已证实某些中药可通过肠道菌群结构及其代谢产物(氧化三甲胺、胆汁酸)改善动脉粥样硬化的发生发展[62]。罗晓雅[63]研究显示，小续命汤可能通过抑制PI3K/AkT/NF-κB及MAPK/JNK信号通路，干预急性脑缺血再灌注大鼠的肠道菌群结构以发挥抗炎和抗凋亡等作用。

7 MAPK信号通路中的分子对接模拟

随着网络药理学和分子对接等现代生物技术的发展，越利于发现中草药中活性成分与动脉粥样硬化相关通路间的联系。将单一化合物与靶点通过IGEMDOCK V2.1软件模拟，以强调其与p38 MAPK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2和ERK5蛋白的结合亲和力。从图1可以看出，这些天然化合物均可与p38 MAPK、JNK1、JNK2、JNK3、ERK1、ERK2和ERK5蛋白对接。分析发现在所有的中药中都有结合强度最低的典型氨基酸，如ASN194、ASN152、ILE70。推测使用中药靶向调节p38 MAPK/JNK/ERK来促进心脏保护主要与这些氨基酸有关。从热图可见，与MAPK核心蛋白对接最紧密的活性成分为黄芩苷，相反川芎嗪最不紧密。

8 问题与展望

动脉粥样硬化是发生在动脉血管壁慢性炎症性疾病，MAPK家族在动脉粥样硬化病理过程中发挥着重要作用。近年来，调控MAPK信号通路防治动脉粥样硬化的细胞及动物实验均取得明显进展。本研究综述了在体内外干预MAPK级联与动脉粥样硬化的活血解毒中药活性成分。研究显示不同的细胞外刺激可通过影响MAPK家族单一成员，引起不同的细胞反应。相反，同一刺激可通过MAPKs家族与动脉粥样硬化机制间的桥梁，引起不同细胞反应。这与中药干预动脉粥样硬化多靶点、多功效的特点不谋而合。

然而，目前中医药通过MAPK信号通路干预动脉粥样硬化的研究主要局限于基础领域，在未来大规模应用前缺乏临床研究领域的反证。药物始终如同一把“双刃剑”，对于中药的安全性需要高度重视。研究应深入到通路及具体靶标。既往研究也发现干预炎症信号通路的药对具有活血解毒的功效[64]。活血解毒中药有效成分可通过调控动脉粥样硬化形成机制与MAPK家族的连接构成治疗动脉粥样硬化的潜在策略。相信随着医学技术的进步和研究技术的不断更新，如蛋白质组学、代谢组学、网络药理学、分子对接等，将会进一步阐明中药有效成分诱导MAPK信号通路改变的新机制，阐明其对提高中药临床疗效的重要性。