长链非编码RNA介导的信号通路在乳腺癌上皮-间充质转化中的研究进展

刘睿，王玉明，唐诗聪

(1.昆明医科大学第二附属医院检验科,昆明 650101； 2.昆明医科大学第三附属医院乳腺外科，昆明 650118)

乳腺癌是女性最常见的癌症之一，也是全球女性癌症死亡的主要原因。近年来，其发病率呈不断上升趋势。对于女性而言，乳腺癌占所有新增癌症病例总数的30%，占癌症死亡人数的15%[1]。尽管在治疗方面，如手术、化疗和分子靶向治疗取得了显著进展，但乳腺癌的总体预后并不令人满意，肿瘤细胞发生转移是造成患者死亡的主要原因之一。乳腺癌的侵袭和转移是一个多原因、多步骤的生物学过程，涉及多种信号通路的激活或沉默，但详细的分子作用机制尚不清楚[2]。由于转移过程中肿瘤的异质性，目前仍缺乏有效的靶向转移治疗药物[3]。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定步骤转化为具有间充质表型细胞的过程，是一种重要的细胞表型变化，EMT的上皮细胞摆脱了组织结构所施加的结构限制[4-5]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种关键的表观遗传修饰因子，是最大的内源性非编码RNA，其可通过改变与乳腺癌转移相关基因的表达，调节不同的细胞信号通路，在乳腺癌转移中起关键作用[6]。现就lncRNA介导信号通路调控乳腺癌细胞EMT过程的分子机制进行综述，为转移性乳腺癌患者提供新的治疗策略。

1 EMT概述

EMT是指具有极性的上皮细胞表型发生改变后，导致细胞间黏附能力下降或丧失，转化为具有迁移能力的间质细胞的过程[3]。EMT的核心要素包括上皮细胞标志蛋白(如上皮钙黏素、桥粒斑蛋白)表达下调，而间充质细胞标志蛋白(如神经钙黏素、波形蛋白)表达上调[5]。此外，许多转录因子，包括锌指转录因子Snail和锌指E盒结合同源异形盒蛋白(zinc finger E-box binding homeobox，ZEB)在EMT诱导的过程中也起重要作用[6]。EMT分为3种类型，Ⅰ型参与胚胎发育；Ⅱ型与生命后期的事件有关，如炎症及伤口愈合等；Ⅲ型主要参与病理生理改变，并与肿瘤的发生以及侵袭转移密切相关[7]。EMT最初见于胚胎形成过程，之后发现与四肢及肺、肾等器官的形成和神经系统的分化有关。然而，EMT在恶性肿瘤的发生发展中也起重要作用，癌症转移是一个复杂的多步骤过程，EMT使原发部位的肿瘤细胞获得运动能力，细胞的侵袭性进一步增强，抗凋亡能力增加。肿瘤细胞从血管或淋巴管中渗出，通过EMT恢复到上皮细胞状态，然后经过不断增殖，可形成继发性肿瘤。所以EMT是导致恶性肿瘤转移和侵袭的第一步，也是最重要的一步[8-9]。乳腺癌转移导致的死亡仍是乳腺癌患者病死的主要原因[3]，而多种信号通路参与EMT的发生，包括磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、Wnt/β联蛋白、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β、Notch信号通路等。因此，寻找可用于检测乳腺癌细胞转移的生物标志物，调控相关信号通路进而抑制癌细胞的转移具有重要临床意义。

2 lncRNA概述

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，广泛存在于基因组中，因存在多种外显子转录，所以大部分不能被翻译成特定蛋白发挥作用，但可与DNA、RNA和蛋白质结合[10]。作为信号分子、诱饵分子、引导分子和骨架分子，lncRNA在转录水平、转录后水平和表观遗传学水平调节基因表达，从而参与肿瘤的发生和发展[11-13]。根据lncRNA在基因组中的位置，可将其分为5种类型：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和基因间lncRNA[3]。随着基因组分析技术的发展，目前已鉴定出许多与生物学相关的lncRNA在各种类型的肿瘤细胞中均存在异常表达，如胃癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌，凸显了lncRNA在癌症多种生物学过程中的重要作用[14]。许多lncRNA已被证实能够调节肿瘤细胞增殖、凋亡、EMT、侵袭和迁移，能够抑制或促进癌症的发生[15]，但lncRNA在癌症中的研究仍处于起步阶段，关于它们如何调节癌症的生物学行为，特别是乳腺癌细胞转移的研究正在进行中。

3 lncRNA调控信号通路参与乳腺癌细胞 EMT

3.1lncRNA通过TGF-β信号通路介导EMT TGF-β参与了EMT，并与肿瘤进展的生理和病理学行为相关[16]。细胞膜上有TGF-β受体(TGF-beta receptor，TGF-βR)Ⅰ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ 3种TGF-βR，其中TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ在细胞质结构域中含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，而TGF-βRⅢ不具有激酶活性[17]。Li等[18]研究发现，lncRNA 12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯的过表达可降低上皮钙黏素的表达，显著升高波形蛋白、血清纤维连接蛋白和TGF-β1的表达，增加细胞的迁移率、迁移能力和侵袭能力。表明12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯可通过TGF-β信号通路影响乳腺癌EMT的发生，进而促进乳腺癌的侵袭转移。此外，有研究报道了TGF-β诱导的小鼠乳腺上皮细胞EMT相关的lncRNA表达特征，超过600个lncRNA在EMT期间显著上调或下调[19]。该研究还发现,lncRNA TGF-β诱导的同源异形盒基因A(homeobox genes A，HOXA)转录物是一种上调的lncRNA，在TGF-β诱导的EMT、细胞迁移和侵袭中起重要作用。TGF-β诱导的HOXA转录物表达下调可逆转上皮钙黏素和波形蛋白的表达[19]。与癌旁组织相比，乳腺癌组织中lncRNA结肠癌相关转录物2(colon cancer-associated transcript 2，CCAT2)的相对信使RNA表达水平显著升高，CCAT2的下调抑制了乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。同时，CCAT2的下调导致乳腺癌细胞周期阻滞在G0/G1期，并促进了细胞凋亡。CCAT2的下调可显著降低乳腺癌细胞中TGF-β、小母同源序列2和α-平滑肌肌动蛋白的表达水平。说明CCAT2可通过调节TGF-β途径，促进乳腺癌细胞凋亡，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭[20]。抗分化非编码RNA被确定为TGF-β下游分子，通过降低Runt相关转录因子2表达对TGF-β1诱导的EMT至关重要，故抗分化非编码RNA可能成为乳腺癌的预后生物标志物和抗转移治疗靶点[16]。

此外，lncRNA可以通过竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)机制调控乳腺癌的EMT进程。ceRNA是转录后水平上广泛报道的调控网络，在ceRNA机制中，lncRNA竞争性地吸附微RNA(microRNA，miRNA/miR)以释放miRNA靶向的信使RNA，从而调节癌症的发生发展[21]。有证据表明，miRNA在癌细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和凋亡的调控中起重要作用[15]。TGF-β/锌指转录因子(slug)/上皮钙黏素轴在EMT和肿瘤转移过程中起关键作用，lncRNA AC026904.1和lncRNA 尿路上皮癌胚抗原1(urothelial carcinoma-antigen 1,UCA1)可以在转录和转录后水平上调slug的表达，在TGF-β诱导的EMT中发挥关键作用。lncRNA AC026904.1和lncRNA UCA1在转移性乳腺癌中过表达。乳腺癌细胞中lncRNA UCA1的上调可显著增强slug和ZEB1的表达，同时降低上皮钙黏素的表达并促进肿瘤细胞迁移。lncRNA UCA1作为ceRNA发挥作用，并被证明通过抑制miR-1和miR-203的表达诱导乳腺癌中slug的表达。同样，lncRNA AC026904.1可能作为ceRNA在TGF-β诱导的EMT中激活slug表达[22]。由此可见，TGF-β信号通路已被广泛研究和认可，是介导调控EMT的重要信号通路，同时lncRNA的异常表达与乳腺癌细胞TGF-β途径的激活、EMT和转移密切相关。

3.2lncRNA通过Notch信号通路介导EMT Notch信号通路是一个经典的信号转导通路，通过Notch受体与配体的相互作用，激活Notch信号通路，在乳腺癌细胞增殖、分化、EMT等中发挥重要调控作用[1]。lncRNA生长抑制特异性转录本5(growth arrest specific transcript 5，GAS5)受Notch-1调节，而Notch-1参与乳腺癌细胞的增殖[23]。表明GAS5可能在Notch诱导的EMT中发挥一定作用。体外干扰GAS5后，可促进乳腺癌亲本细胞株发生EMT表型改变，EMT相关蛋白上皮钙黏素表达下调，波形蛋白表达上调。而在乳腺癌耐药细胞株中过表达GAS5可抑制乳腺癌耐药细胞株EMT表型和侵袭能力，并提高紫杉醇的药物敏感性。裸鼠EMT模型中，过表达GAS5通过逆转EMT标志蛋白，从而提高紫杉醇抑制肿瘤的生长和肺转移的作用，表明GAS5表达与EMT诱导存在负相关，因此GAS5可作为乳腺癌EMT形成和转移判断的潜在标志物[24]。Sun等[15]发现，lncRNA核仁小RNA宿主基因(small nucleolar RNA host gene，SNHG)7在乳腺癌组织和细胞系中显著上调，敲低lncRNA SNHG7可显著抑制人乳腺癌细胞的增殖和侵袭，证实lncRNA SNHG7靶向miR-34a并促进乳腺癌中EMT的启动和Notch-1途径。总之，lncRNA SNHG7通过EMT启动和Notch-1途径竞争性地吸附miR-34a，从而促进乳腺癌的发生和发展。

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是最具侵袭性的乳腺癌亚型之一，几乎占所有乳腺癌亚型的20%，由于缺乏敏感的治疗标志物，如雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2，TNBC管理仅涉及标准化疗和放疗，导致预后不良[3,9]。研究表明，与人乳腺癌细胞相比，linc-OIP5和Notch配体1在TNBC细胞系MDA-MB-231中高表达。新血管的形成是肿瘤转移的第一步。MDA-MB-231细胞与人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)共培养后，MDA-MB-231细胞中linc-OIP5的表达被下调，HUVECs的血管形成和迁移受到抑制，HUVECs表面Notch1的表达均降低，表明linc-OIP5通过Notch信号通路调节HUVECs的促血管生成作用，从而促进TNBC转移[25]。这些发现有助于更好地了解乳腺癌的发病机制，证实EMT的发生与癌细胞的侵袭迁移密切相关，且在Notch信号通路中发挥重要作用，该信号通路也是肿瘤相关研究的热点。

3.3lncRNA通过Wnt/β联蛋白信号通路介导EMT Wnt信号通路是一种高度保守的信号通路，在正常发育和疾病进展过程中调节多种生物过程，Wnt/β联蛋白是诱导肿瘤细胞EMT过程的关键通路之一，可以影响肿瘤的进展和转移。上皮钙黏素和β联蛋白是该通路的核心因子，并作为关键的信号介质发挥作用。典型Wnt信号通路的激活导致细胞质和细胞核中的β联蛋白水平升高，最终激活下游靶基因的转录，抑制Wnt/β联蛋白通路可抑制EMT和乳腺癌细胞的侵袭[26]。敲除LINC01234可抑制TNBC细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT过程，并促进细胞凋亡。LINC01234与miR-525-5p和miR-525-5p靶向骨髓嗜病毒插入位点2来调节Wnt通路的激活。总之，LINC01234通过调节miR-525-5p/骨髓嗜病毒插入位点2轴和激活Wnt/β联蛋白信号通路，促进TNBC细胞的EMT[27]。同样，lncRNA HOXA远端转录物反义RNA表达下调后，乳腺癌细胞的迁移和侵袭显著降低，同时乳腺细胞的EMT在lncRNA HOXA远端转录物反义RNA下调后受到抑制，表现为上皮钙黏素水平升高，神经钙黏素和Snail的表达水平降低，β联蛋白的表达也显著降低；过表达β联蛋白后，促进乳腺癌细胞的细胞迁移、侵袭和EMT，揭示了Wnt/β联蛋白信号通路在这一过程中的潜在作用[28]。此外，下调lncRNA UCA1的表达，也抑制了β联蛋白的蛋白表达水平，导致β联蛋白下游基因，包括细胞周期蛋白D1和基质金属蛋白酶7的转录减少。基于这些发现，推断lncRNA UCA1上调至少部分通过激活Wnt/β联蛋白信号通路增加乳腺癌细胞的侵袭[26]。除上述研究外，lncRNA UCA1通过Wnt/β联蛋白信号通路影响耐药细胞的EMT也被报道。lncRNA UCA1的下调通过阻断乳腺癌细胞中的Wnt/β联蛋白信号通路增强他莫昔芬的敏感性，而UCA1的过度表达通过激活Wnt/β联蛋白信号通路刺激乳腺癌细胞中的EMT。与lncRNA UCA1相似，亲代乳腺癌细胞系和三苯氧胺耐药细胞系中，lncRNA H19表达水平能影响乳腺癌细胞增殖。H19的下调刺激三苯氧胺耐药乳腺癌细胞中β联蛋白从核转移到细胞质，并上调乳腺癌细胞中上皮钙黏素和波形蛋白的表达。因此，H19基因的敲除通过Wnt途径抑制三苯氧胺耐药乳腺癌细胞的EMT[29]。这些研究表明，Wnt/β联蛋白信号通路可能成为一种新的分子靶标，在治疗转移性乳腺癌中发挥关键作用，lncRNA与Wnt/β联蛋白信号通路间的调控网络将为探寻肿瘤的EMT进程提供新的思路和方法。

3.4lncRNA通过PI3K/Akt信号通路介导EMT PI3K/Akt信号通路作为介导EMT的重要通路之一也得到广泛研究，PI3K是该途径的重要组成部分，在许多癌症中异常表达。PI3K信号通路通过一系列影响肿瘤生物学行为的复杂过程激活Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶。GAS5作为一种ceRNA发挥作用，GAS5的上调可抑制miR-196a-5p的表达，并通过激活下游叉头框蛋白O1/PI3K/Akt信号通路抑制乳腺癌的侵袭。GAS5的上调通过增强叉头框蛋白O1的表达来阻止PI3K和Akt的磷酸化。而miR-196a-5p的异位表达显示出相反的效果，不改变PI3K和Akt的总表达[30]。Zhang等[6]发现，lncRNA ZEB2-反义RNA1在乳腺癌组织和细胞中显著上调，尤其是在转移性肿瘤样本和高侵袭性细胞中被认为是TNBC的癌基因。它主要位于核内，在ZEB2附近，ZEB2是lncRNA ZEB2-反义RNA1的直接靶点，lncRNA ZEB2-反义RNA1通过PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β/ZEB2信号通路积极调节ZEB2表达并激活EMT。与lncRNA ZEB2-反义RNA1类似，lncRNA性别决定区Y框转录因子21-反义RNA1在乳腺癌中高表达，磷酸化的PI3K和Akt水平也升高。细胞实验表明，抑制lncRNA性别决定区Y框转录因子21-反义RNA11表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT，而加入PI3K/Akt通路的抑制剂LY294002干预后，可逆转敲低lncRNA性别决定区Y框转录因子21-反义RNA11对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的促进作用。可见，lncRNA性别决定区Y框转录因子21-反义RNA11可以通过调节PI3K/Akt信号通路促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和EMT，这可能是其诊断和治疗的新靶点[31]。另外，lncRNA 运动神经元和胰腺同源盒1-反义RNA1作为一种功能性癌基因，在乳腺癌中诱导EMT并激活Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路和运动神经元和胰腺同源盒1[32]。由此可见，lncRNA介导PI3K/Akt信号通路在乳腺癌的发展和进展中具有重要作用，探索其在乳腺癌中的潜在机制，可为乳腺癌的临床诊断和治疗提供新的方向和见解。

3.5lncRNA通过其他信号通路介导EMT lncRNA也可通过其他信号通路调节EMT，参与乳腺癌的肿瘤发生和转移。lncRNA H19和肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8(tumor necrosis factor-alpha induced protein 8，TNFAIP8)在乳腺癌组织和细胞系中的表达上调，尤其是在TNBC中，lncRNA H19拮抗p53并增加其靶基因TNFAIP8的表达以促进EMT过程；裸鼠模型中，沉默lncRNA H19或TNFAIP8也可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的肿瘤发生和淋巴结转移[33]。所以，lncRNA H19可通过p53/TNFAIP8途径促进TNBC细胞的侵袭和转移。Qian等[34]指出，lncRNA SNHG8在TNBC细胞中的表达显著上调，SNHG8可以调节miR-335-5p促进TNBC细胞的增殖、迁移和EMT。同样，与正常组织或乳腺成纤维细胞相比，lncRNA 无远端同源框6反义RNA1在TNBC组织和细胞系中的表达水平增加，其可通过体外和体内TNBC中的miR-199b-5p/桩蛋白信号转导促进细胞增殖和EMT[35]。此外，lncRNA在乳腺癌的血管生成中也具有重要的调节作用。有研究发现，核因子κB相互作用lncRNA过表达可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移，促进细胞凋亡；同时其还可通过核因子κB信号通路减少白细胞介素-6的分泌来抑制HUVECs的增殖、迁移和血管生成[36]。虽然这些信号通路的研究相对较少，但其在调节EMT、影响乳腺癌发生和进展过程中的作用不可忽视。

4 小 结

虽然lncRNA在乳腺癌EMT肿瘤转移中起关键作用，但其调节功能和分子机制仍有待阐明，在不同乳腺癌亚型中的作用也需进一步研究。EMT的发生与多种转录因子和信号通路有关，它们之间形成一个错综复杂的调控网络，且这些关键因子可能作为肿瘤转移的预测性分子标志物及肿瘤治疗的分子靶标。同一lncRNA可能调控多种信号通路影响乳腺癌细胞的EMT，也可能调控多种信号通路共同发挥作用，如lncRNA H19既可以通过Wnt/β联蛋白信号通路影响乳腺癌细胞EMT，又可以通过p53/TNFAIP8途径促进TNBC细胞的侵袭和迁移。lncRNA 可以被视为各种肿瘤的新型EMT标志物，而基于ceRNA机制的研究也为lncRNA相关EMT提供了新的认识。此外，对调控EMT的转录因子及其相关信号通路进行深入研究，有助于更好地了解肿瘤EMT及其分子机制。